Cómo utilizar la dispersión lateral violeta (V-SSC) para detectar nanopartículas en el citómetro de flujo CytoFLEX

Autores:
George C. Brittain, Ph.D.
Sergei Gulnik, Ph.D.

Afiliación: 
Beckman Coulter Life Sciences, Miami, FL 33196

En este artículo, aprenderá a:

  • Probar de modo empírico el umbral inferior para detección de nanopartículas en su citómetro de flujo
  • La capacidad de detectar partículas pequeñas está directamente correlacionada con la longitud de onda de la luz utilizada para detección
  • El uso de la dispersión lateral violeta en el CytoFLEX permite la detección y resolución de nanopartículas

Antecedentes

La detección de partículas submicrónicas por citometría de flujo se vuelve cada vez más difícil según los tamaños de las partículas pasan a ser más pequeños que la longitud de onda de la luz que se está utilizando para detectarlas. La detección estándar de partículas submicrónicas por dispersión frontal es problemática porque tienen una huella de dispersión inferior debido a un área transversal menor, y hay una tendencia creciente de refracción isotrópica de la luz polarizada ortogonalmente con tamaños de partícula decrecientes (Hielscher et al., 1997).

Si bien esas propiedades alteran la resolución de partículas submicrónicas debido al ruido por dispersión frontal, ellas en realidad mejoran su detección y resolución por dispersión lateral. Al utilizar la dispersión lateral para detectar partículas pequeñas, una variedad de factores puede influir en su detección, tales como las diferencias entre los índices de refracción de las partículas y sus medios circundantes, y la complejidad interna de las partículas que se están detectando. En general, cuanto mayor sea la diferencia en los índices de refracción, más luz dispersarán las partículas; y cuanto más granular sea la composición de las partículas (es decir, vesículas intracelulares, agregados de proteínas, iones metálicos, etc.), más luz dispersarán los componentes de las subpartículas. Además, la cantidad de luz dispersada por cualquier partícula es directamente proporcional al diámetro de la partícula e inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz que se está utilizando para detectarla.

Esa relación se puede observar en las ecuaciones de la Teoría de Mie y la Dispersión Raleigh de la Luz, que se utilizan para calcular la dispersión teórica de la luz por partículas de tamaño similar o mucho más pequeño que la longitud de onda de la luz que se está utilizando para detectarlas, respectivamente (Bohren & Huffmann, 2010). Por ese motivo, la longitud violeta de menor onda (405 nm) tendrá como resultado una dispersión de luz más ortogonal con cualquier tamaño de partícula dado en comparación con la longitud de onda azul (488 nm), y aumentará el rango de resolución a partículas más pequeñas que se pueden detectar por dispersión lateral estándar. Además, al entrar en un medio de un distinto índice de refracción, las ondas luminosas sufren refracción por el nuevo medio inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz, y las longitudes de onda más pequeñas presentan una refracción mayor que las longitudes de onda más grandes. Ese efecto lo descubrió primero Isaac Newton cuando descompuso la luz blanca en un arco iris de colores individuales utilizando un prisma, con la luz roja refractándose menos y la luz violeta se refractándose más (Figura 1) (Newton, 1704).

Con base en esa propiedad física, el uso de luz violeta ayudará a amplificar las diferencias en los índices de refracción entre las partículas y sus medios circundantes, y a su vez aumenta la capacidad de detectar partículas con un índice de refracción más bajo, como los exosomas, microvesículas y nanopartículas de sílice. El propósito de este artículo es demostrar cómo configurar el citómetro de flujo CytoFLEX para detectar partículas pequeñas por Dispersión Lateral Violeta (V-SSC). Para consideraciones prácticas importantes para el análisis de partículas pequeñas por citometría de flujo, consulte las publicaciones recientes (Nolan, 2015; Poncelet et al., 2015; Arraud et al., 2015).

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