Cómo la dispersión lateral violeta permite la detección de nanopartículas

George C. Brittain, Ph.D., Sergei Gulnik, Ph.D., Beckman Coulter Life Sciences, Miami, FL 33196

Antecedentes

La detección de partículas submicrométricas por citometría de flujo se hace cada vez más difícil a medida que el tamaño de las partículas se hace más pequeño que la longitud de onda de la luz que se utiliza para detectarlas. Además, la cantidad de luz dispersada por cualquier partícula es directamente proporcional al diámetro de la partícula e inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz utilizada para detectarla. Esta relación se puede ver en las ecuaciones tanto de la teoría de Mie como de la dispersión de luz de Raleigh, que se utilizan para calcular la dispersión teórica de la luz por partículas de tamaño similar o mucho menor que la longitud de onda de la luz que se utiliza para detectarlos, respectivamente (Bohren & Huffmann, 2010). Por este motivo, la menor longitud de onda violeta (405 nm) resultará en una mayor dispersión de luz ortogonal en cualquier tamaño de partícula que la longitud de onda azul (488 nm), y aumentará el intervalo de resolución a partículas más pequeñas de las que las que pueden detectarse con la dispersión lateral estándar. Además, al entrar en un medio con un índice de refracción diferente, las ondas de luz son refractadas por el nuevo medio de forma inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz, siendo las longitudes de onda más pequeñas las que tienen una refracción más alta que las longitudes de onda más grandes. Este efecto fue descubierto por primera vez por Isaac Newton cuando dividió la luz blanca en un arco iris de colores individuales usando un prisma, siendo la luz roja la que menos se refractaba y la luz violeta la que más se refractaba (Figura 1) (Newton, 1704).

Sobre la base de esta propiedad física, el uso de luz violeta ayudará a amplificar la diferencia en los índices de refracción entre las partículas y los medios circundantes, y a su vez aumenta la capacidad de detectar partículas con un índice de refracción más bajo, como exosomas, microvesículas y nanopartículas de sílice. El propósito de este documento es demostrar cómo se configura el citómetro de flujo CytoFLEX para detectar partículas pequeñas mediante dispersión lateral violeta (VSSC). 



Figura 1. Una representación simplificada de la refracción de luz newtoniana a través de una célula basada en la longitud de onda. 

Configuración del CytoFLEX para detectar la dispersión lateral violeta

La configuración de la detección de la VSSC en el CytoFLEX es sencilla. En el programa CytExpert, simplemente seleccione la pestña Citómetro contenida en la barra de menú y luego seleccione Configuración del detector. En la ventana emergente Configuración de la detección, sustituya el filtro de 450 nm por el filtro de 405 nm y etiquete adecuadamente el detector como VSSC. Tras guardar la configuración del detector, seleccione esa configuración para que sea la configuración actual y mueva físicamente el filtro de 405 nm a la ranura de 450 nm dentro del instrumento. Llegado a este punto, deberá iniciar un nuevo experimento dentro del programa CytExpert para que se aplique la nueva configuración del detector, y estará listo para empezar.

Una vez en ejecución, a fin de separar apropiadamente las nanopartículas del ruido de fondo utilizando la VSSC, deberá abrir el menú de Configuración de la Adquisición, seleccionar VSSC como activador principal (Altura es mejor que Área) y luego ajustar manualmente el nivel de activación hasta que alcance el umbral de discriminación entre el ruido y los eventos reales. Este nivel de activación suele ser muy coherente con el CytoFLEX en cualquier ajuste dado de intensidad y ganancia del láser, tanto entre experimentos como en días diferentes.

Algunas consideraciones que debe tener en cuenta: necesitará ajustar el intervalo del histograma de la VSSC para afinarlo al intervalo de tamaño de interés dado que los valores predeterminados de la tabla tendrán las partículas más pequeñas empujadas contra el eje y; una vez dentro de ese intervalo, una escala logarítmica proporcionará una mejor distribución de los tamaños de partículas multimodales; y, si la escala del eje de recuentos se selecciona como “Ajustar a la muestra”, siempre volverá a escalar los datos para que quepan en todo el histograma. Esta última cuestión puede crear confusión, especialmente si establece el activador de umbral utilizando solo el buffer en lugar de determinarlo empíricamente utilizando las partículas de interés más pequeñas. En este caso, el histograma de ruido seguirá reajustándose al máximo independientemente de dónde coloque el activador, y sin las partículas como referencia, el ajuste de activación elegido podría aislar o eliminar las partículas de interés cuando comience a realizar pruebas. Lo mejor es ajustar el activador utilizando las partículas detectables más pequeñas que haya disponible que puedan discriminarse claramente del ruido de fondo. Utilizando estas partículas, puede afinar sobre la población de muestra real y luego retroceder el activador hasta que se sienta cómodo con el nivel de ruido que queda (Figura 2). Sin embargo, si el nivel de umbral elegido es demasiado bajo, tendrá una mayor tasa de anulación debido al ruido. En última instancia, debería intentar mantener la tasa de anulación por debajo del 5-10 %, ya sea ajustando el umbral, la concentración de la muestra o el caudal. Mantener la concentración de la muestra y el caudal bajos es también importante para evitar observaciones experimentales imprecisas debido a coincidencia (p. ej., enjambrazón) (Nolan, 2015; Nolan & Stoner, 2013).


Figura 2 VSSC

Figura 2. Ejemplo de separación entre una población de muestra real y el ruido de fondo mientras se establece el umbral de activación de la VSSC. Esta muestra es de esferas de poliestireno de 100 nm a una dilución de 1:100K en agua filtrada a 0,02 mm.

Consideraciones para la preparación de las muestras

El análisis de micropartículas y nanopartículas requiere una preparación cuidadosa de las muestras que vayan a analizar. En primer lugar, el tampón en el que se suspendan las muestras se debe filtrar con un corte de peso molecular adecuado para eliminar cualquier residuo de fondo que pueda estar dentro del intervalo de sus poblaciones de interés. En segundo lugar, como se menciona habitualmente en los protocolos y las hojas de datos, las muestras no deben mezclarse de forma tan vigorosa como para crear burbujas de aire inmediatamente antes de la lectura. Estas burbujas interferirán en la adquisición de datos, ya que
también refractan la luz y por lo tanto se detectarán como eventos. En tercer lugar, muchas partículas sintéticas pequeñas tienen tendencia a unirse entre sí, lo que da lugar a la formación de agregados que pueden llegar a medirse de manera imprecisa o a anularse de forma conjunta. En el caso de burbujas o agregación, sonicar las muestras antes de la lectura puede ayudar. Tras la sonicación, las muestras deberían leerse lo más rápido posible, ya que la agregación comenzará de nuevo y las poblaciónes de muestra se verán afectadas con el tiempo (Figura 3). Si la sonicación no es aceptable, como en el caso de muestras biológicas, basta con triturar las muestras lo mejor posible para que la muestra se distribuya uniformemente antes de la adquisición. Por último, también se debe valorar la concentración de la muestra a fin de determinar el intervalo de trabajo óptimo para la adquisición mediante citometría de flujo, ya que las concentraciones más elevadas darán lugar a la agregación y/o la enjambrazón (figura 4). 

 

Figura 3 VSSC

Figura 3. La reducción de señal de una población de nanopartículas de poliestireno en el tiempo. Estas muestras son esferas de poliestireno de 100 nm a una dilución de 1:100K en agua filtrada de 0,02 mm leídas a 0, 30 o 60 minutos después de la sonicación.

Figura 4 VSSC

Figura 4. Encontrar la concentración óptima para la muestra de nanopartículas. Estas muestras son esferas de poliestireno de 100 nm en agua filtrada a 0,02 µm a una dilución de 1:1K, 1:10K o 1:100K a partir de solución concentrada al 1 %. A partir de estos resultados, se pudo ver claramente que 1:100K proporciona tanto la mejor señal como la menor agregación o enjambrazón de las diluciones probadas.

 

Análisis de rendimiento del CytoFLEX con detección de nanopartículas mediante dispersión lateral violeta

 

El objetivo del siguiente experimento fue demostrar la capacidad del CytoFLEX para detectar nanopartículas menores que 200 nm mediante el uso de la VSSC.

Instrumento y reactivos

PRODUCTO Número de catálogo empresa 
 CytoFLEX de 3 láseres   B53000  Beckman Coulter 
 Fluido envolvente CytoFLEX  B51503  Beckman Coulter 
 Filtros Whatman Anotop 25 de 0,02 μm   09-926-13  Thermo Scientific 
 Esferas de poliestireno de 40 nm NIST  09-980-015  Thermo Scientific 
 Esferas de poliestireno de 100 nm NIST  09-980-021  Thermo Scientific 
 Esferas de poliestireno de 200 nm NIST  09-980-024  Thermo Scientific 
 Estándares de tamaño de partículas multimodal  MM-010  Thermo Scientific 
 Esferas de sílice de 94 nm NIST   147020-10  Corpuscular, Inc.
 Esferas de sílice de 150 nm NIST   147030-10  Corpuscular, Inc
 Esferas de sílice de 200 nm NIST  147040-10  Corpuscular, Inc

Resultados
En primer lugar comparamos la sensibilidad de la detección de nanopartículas mediante la VSSC de 405 nm respecto a la SSC estándar de 488 nm utilizando estándares de tamaño de partículas multimodal Duke con una mezcla de esferas de poliestireno de 80 nm, 200 nm y 500 nm. Como se puede observar en la Figura 5A, la VSSC pudo discriminar fácilmente las partículas más pequeñas de 80 nm y 200 nm, mientras que la SSC no ha empezado a discriminar las poblaciones hasta entre 200 nm y 500 nm. Al determinar la relación señal-ruido de las diferentes poblaciones detectadas mediante FSC, SSC o VSSC, se puede ver que la VSSC se desempeña mejor que la SSC en todos los tamaños de partículas medidos (Figura 5B). Utilizando el histograma puede ver con mayor claridad las densidades de población y que el CytoFLEX con la VSSC fue capaz de discriminar con facilidad las nanopartículas de poliestireno de hasta 80 nm utilizando los estándares de tamaño de partículas multimodal Duke (Figura 6). Las partículas de poliestireno tan pequeñas como 40 nm pudieron detectarse claramente por encima del fondo, pero se encontraban justo en el umbral de ruido (Figura 7). Dado que las esferas de poliestireno tienen un índice de refracción de 1,5915 (a 589 nm), también hemos probado las nanopartículas de sílice con un índice de refracción de 1,4584 (a 589 nm), más cerca del intervalo de los exosomas y microsomas, que tienen un índice de refracción medio de alrededor de 1,426 (Gardiner et al., 2014). Como resultado, pudimos discriminar fácilmente nanopartículas de sílice de 150 nm y 200 nm, mientras que las nanopartículas de sílice de 94 nm fueron detectables, pero en el umbral de ruido (Figura 8).

Figura 5.1 VSSC             Figura 5.2 VSSC

Comparación de la sensibilidad de la detección de nanopartículas mediante VSSC de 405 nm con la SSC de 488 nm. Los estándares de tamaño de partículas multimodal Duke (80 nm, 200 nm y 500 nm) en agua filtrada a 0,02 μm a una dilución de 1:10K se analizaron utilizando el CytoFLEX. Gráfico de puntos que muestra la VSSC frente a la SSC (A). Un gráfico de las relaciones señal-ruido para las diferentes nanopartículas utilizando FSC, SSC o VSSC. B:.

Figura 6.1 VSSC                         Figura 6.2 VSSC

Detección y discriminación de las nanopartículas de poliestireno de 80 nm, 200 nm y 500 nm mediante VSSC y SSC. Estos son estándares de tamaño de partículas multimodal Duke (80 nm, 200 nm y 500 nm) en agua filtrada a 0,02 μm a una dilución de 1:1K, 1:10K o 1:100K a partir de la solución concentrada al 1 % detectada mediante VSSC de 405 nm (A) y SSC de 488 nm (B).

Figura 7.1 VSSC          Figura 7.2 VSSC

. Comparación de la detección por dispersión de 405 nm y 488 nm de nanopartículas de poliestireno de 40 nm. Estas muestras son esferas de poliestireno de 40 nm o 100 nm en agua filtrada a 0,02 μm a una dilución de 1:10K o 1:100K, respectivamente (concentrado al 1 %) detectadas mediante VSSC de 405 nm (A) o SSC de 488 nm (B).

Figura 8.1 VSSC            Figura 8 VSSC

Comparación de la detección por dispersión de 405 nm y 488 nm de nanopartículas de sílice. Estas muestras son nanopartículas de sílice de 94 nm, 150 nm o 200 nm o de nanopartículas de poliestireno de 100 nm en PBS filtrado a 0,02 μm. Las nanopartículas de sílice se diluyeron 1:10K, mientras que las nanopartículas de poliestireno se diluyeron 1:100K, a partir de la solución concentrada al 1 %, y se detectaron mediante VSSC de 405 nm (A) o SSC de 488 nm (B).

 

Conclusiones

Utilizando VSSC, el CytoFLEX pudo discriminar claramente las nanopartículas de poliestireno de 80 nm y las de sílice de 150 nm del ruido de fondo. Además, la detección y la discriminación de nanopartículas por VSSC fueron mejores que las efectuadas por SSC para todos los tamaños de partículas probados. Según estos hallazgos, podemos decir con confianza que el CytoFLEX se puede utilizar para detectar vesículas extracelulares al menos tan pequeñas como 150 nm mediante VSSC. Es posible que se pueda utilizar la VSSC para detectar vesículas aún más pequeñas, ya que las investigaciones anteriores han sugerido que el índice de refracción de las vesículas extracelulares es inversamente proporcional al tamaño de las vesículas, con las pequeñas vesículas de 50 nm teniendo un índice de refracción de cerca 1,6 (similar al poliestireno) (Gardiner et al., 2014); sin embargo, esto se tendrá que determinar empíricamente.

Referencias
1. Arraud, N., Gounou, C., Turpin, D., Brisson, A.R (2015). Fluorescent triggering: a general strategy for enumeration and phenotyping extracellular vesicles in flow cytometry. Cytometry Part A, doi: 10.1002/cyto.a.22669. [Epub antes de imprenta]
2. Bohren, C.F. & Huffmann, D.R. (2010). Absorption and scattering of light by small particles. New York: WileyInterscience.
3. Gardiner, C., Shaw, M., Hole, P., Smith, J., Tannetta, D., Redman, C.W., and Sargent, I.L. (2014). Measurement of refractive index by nanoparticle tracking analysis reveals heterogeneity in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, 3: 25361-25366.
4. Hielscher, A.H., Mourant, J.R., and Bigio, I.J. (1997). Influence of particle size and concentration on the diffuse backscattering of polarized light from tissue phantoms and biological cell suspensions. Applied Optics, 36(1): 125-135.
5. Newton, I. (1704). Opticks: or, a treatise of the reflexions, refractions, inflexions and colours of light. Also two treatises of the species and magnitude of curvilinear figures. London: Samuel Smith & Benjamin Walford (Printers to the Royal Society).
6. Nolan J.P. (2015) Curr Protoc Cytom. 73: 13.14.1-13.14.16.
7. Nolan, J.P, & Stoner, S.A. (2013). A trigger channel threshold artifact in nanoparticle analysis. Cytometry Part A, 83(3): 301-305.
8. Poncelet, P., Robert, S., Bouriche, T., Bez, J., Lacroix, R., Dignat-George, F. Cytometry Part A doi: 10.1002/ cyto.a.22685. [Epub antes de imprenta]

 

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