Análisis avanzado de subconjuntos de linfocitos T humanos en el citómetro de flujo CytoFLEX utilizando un reactivo seco DURAClone de 13 colores en tubo

Tipo de contenido: Nota técnica
Autores: Nicole Weit1, Michael Kapinsky2, Andreas Böhmler1

Afiliación:

1 Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemania

2 Beckman Coulter Immunotech S.A.S, Marsella, Francia

Resumen

La citometría de flujo multicolor es una herramienta potente para analizar el compartimento de linfocitos T humanos altamente heterogéneo. Utilizando el kit de reactivo seco de subconjuntos de linfocitos T DuraClone IM de 10 colores (CD45RA-FITC, CD197-PE, CD28-ECD, CD279-PC5.5, CD27-PC7, CD4-APC, CD8-Alexa-Fluor* 700, CD3-APC-Alexa-Fluor* 750, CD57-Pacific Blue*, CD45-Krome Orange) más 3 anticuerpos líquidos adicionales para el láser violeta (anticuerpos Brilliant Violet 605TM anti-human CD95, Brilliant Violet 650TM anti-human CD25 y Brilliant Violet 785TM anti-human CD127), hemos definido un tubo de 13 colores que permite la identificación de los subconjuntos de linfocitos T principales de acuerdo con los criterios clásicos y más recientes con un esfuerzo mínimo en la preparación de la muestra.

Introducción

Los linfocitos T forman una parte esencial del sistema inmunitario adaptativo y, por lo tanto, son de gran interés para la comunidad de investigación. Dos ejemplos recientes son el trabajo del consorcio internacional ONE Study (www.onestudy.org) y BIO-DriM (www.biodrim.eu), grupos internacionales de expertos en el campo de la monitorización inmunitaria, financiado por la Comisión Europea. Dentro de estos enfoques, las selecciones de marcadores y colorantes para la citometría de flujo han sido diseñadas y optimizadas por laboratorios de flujo expertos para monitorizar la respuesta inmunitaria humana [1].

La estrecha cooperación entre estos grupos y Beckman Coulter dio como resultado el desarrollo de la marca DuraClone IM de reactivos secos para el análisis de células inmunitarias humanas. Utilizando el kit de subconjuntos de linfocitos T DuraClone IM de 10 colores más 3 marcadores líquidos adicionales, se ha diseñado un tubo de 13 colores para el análisis fenotípico de subpoblaciones de linfocitos T principales en la sangre periférica humana.

Procedimiento estándar

Tras el consentimiento informado, se añadieron 100 μl de sangre periférica humana de un donante sano a un tubo de reactivo seco de subconjuntos de linfocitos T DuraClone (Beckman Coulter), seguido de 5 μl de cada uno de los anticuerpos Brilliant Violet 605TM anti-human CD95, Brilliant Violet 650TM anti-human CD25, y Brilliant Violet 785TM anti-human CD127 (BioLegend). Las células se mezclaron durante 8 s, se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad y se lisaron los eritrocitos añadiendo 2 ml de solución lisante VersaLyse más 50 μl de solución de fijación IOTest 3 (ambas de Beckman Coulter). Después de la incubación (20 min a TA), se centrifugó la suspensión (200 x g, 5 min), se descartó el material sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 3 ml 1 x PBS. Después de un paso de centrifugación adicional (véase arriba), se resuspendió el precipitado celular en 500 μl 1 x PBS para análisis posteriores en un Sistema CytoFLEX de citometría de flujo de 13 colores y 3 láseres (Beckman Coulter).

Resultados

Los análisis de subconjuntos de linfocitos T basados en la expresión diferencial de moléculas de superficie relacionadas con la función, diferenciación o activación celular han evolucionado [2]. Como resultado, el análisis de linfocitos T requiere una multitud de marcadores para capturar las diversas poblaciones que se han descrito [3]. El tubo de 13 colores que se presenta aquí permite la identificación de la mayoría de las subpoblaciones de memoria de linfocitos T que se pueden caracterizar mediante patrones de expresión de marcadores de superficie. Es adecuado para todos los citómetros de flujo con diseño óptico 5-3-5 (488 y 561 nm/638 nm/405 nm) y reduce la preparación de la muestra a prácticamente 4 pasos de pipeteo.

Referencias

1. Streitz M. et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplantation Research 2013 2:17.
2. Appay V. et al. Phenotype and function of human T lymphocyte subsets: consensus and issues. Cytometry A 2008 73A: 975.
3. Mahnke Y.D. et al. The who’s who of T-cell differentiation: Human memory T-cell subsets. Eur. J. Immunol. 2013 43: 2797.

Notas

Los resultados demostrados en esta hoja de aplicación representan aquellos generados en el citómetro de flujo CytoFLEX de Beckman Coulter con configuración láser de 488 nm/638 nm/405 nm. Dado que existen diferencias de rendimiento entre analizadores, el autor no puede garantizar una apariencia similar con el uso de otros citómetros de flujo.

Reagent Details (Datos del reactivo)

Reactivo       Proveedor    Detalles del pedido
Kit de subconjuntos de infocitos T Duraclone IM       Beckman Coulter     B53328
VersaLyse Lysing Solution (solución de lisado)       Beckman Coulter     A09777 o§ IM3648  
 IOTest 3 Fixative Solution (solución de fijación)       Beckman Coulter     A07800 o§ IM3515 
 Brilliant Violet 605 anti-human CD95       BioLegend     305628
 Brilliant Violet 650 anti-human CD25       BioLegend     302634
 Brilliant Violet 785 anti-human CD127       BioLegend     351330

 

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