Automatización de la extracción de ADN genómico de sangre completa y suero con GenFind V3 en la estación de trabajo genómica híbrida Biomek i7

Tipo de contenido: Póster
Autores: M. C. Randy Pares; Dra. Li Liu; Dr. Han Wei; Mary Blair

Resumen

El aislamiento de ADN genómico de alta calidad (gDNA) es el precursor de muchos ensayos de biología molecular. El nuevo kit de aislamiento de ADN de sangre y suero GenFind V3 de Beckman Coulter utiliza la tecnología patentada de esferas paramagnéticas de inmovilización reversible de fase sólida (Solid Phase Reverse Immobilization, SPRI) para aislar ADN genómico de sangre completa fresca o congelada y suero conteniendo anticoagulantes de citrato, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o heparina, así como de células cultivadas. GenFind V3 utiliza un tampón de lisis celular y un tratamiento con proteinasa K mejorados para romper las membranas celulares y digerir las proteínas a fin de proporcionar de manera constante gADN de alta calidad con rendimientos y pureza mejorados. El kit GenFind V3 admite volúmenes de entrada de muestras de hasta 400 µl de sangre o suero o dos millones de células cultivadas, y se puede realizar en un formato de placa de 96 pocillos o de tubos. Además, la necesidad de extracciones de sangre completa de gran volumen continúa creciendo, junto con la capacidad de automatizar de manera sencilla el proceso para reducir los errores del usuario. Para abordar esta necesidad, se dispone de un protocolo que admite >400 µl y hasta 2 ml de sangre completa que también se puede realizar de forma automatizada utilizando una placa de 24 pocillos. Volúmenes superiores a 2 ml se pueden realizar en un formato de tubos. Actualmente, también estamos en proceso de integración de un Thermo Scientific KingFisher™ Presto en la serie i para permitir el procesamiento de un mayor volumen y una producción más rápida.

Demostramos aquí una solución automatizada sencilla para el kit GenFind V3 para purificar hasta 400 µl de sangre completa utilizando la estación de trabajo genómica híbrida Biomek i7 de Beckman Coulter. El método Biomek Serie i es un proceso de purificación de ácidos nucleicos robusto y de alto rendimiento que puede procesar hasta 96 muestras en un formato de 96 pocillos en menos de 3,5 horas con interacción mínima del usuario y sin centrifugación externa o filtrado de vacío. El método también es compatible con la estación de trabajo de NGS (secuenciación de nueva generación) Biomek serie i, lo que facilita el proceso de instalación para los usuarios de Biomek Serie i existentes.

Materiales y métodos

Se recogió sangre completa de cuatro donantes individuales en tubos de recogida de sangre recubiertos con anticoagulantes de EDTA, citrato y heparina. Se utilizaron cuatro réplicas técnicas para cada donante y se dividieron en alícuotas un total de 48 muestras de 400 µl en una placa de pocillos profundos Abgene de 2,2 ml (16 de EDTA, 16 de citrato y 16 de heparina). Luego se extrajo ADN genómico utilizando el método automatizado de aislamiento de ADN de sangre y suero GenFind V3 implementado en la plataforma híbrida Biomek i7. Todas las muestras de ADN genómico extraídas se analizaron utilizando un NanoDrop One (Thermo Scientific). Se seleccionaron al azar 15 muestras (cinco de EDTA, cinco de citrato y cinco de heparina) y se analizaron utilizando el TapeStation 2200 con el kit ScreenTape de DNA genómico (Agilent Technologies). Esas mismas 15 muestras de ADN genómico se convirtieron luego a bibliotecas de secuenciación NGS utilizando el kit Kapa HyperPlus implementado en la estación de trabajo de NGS Biomek Serie i5. El control de calidad (CC) de la biblioteca NGS se realizó utilizando el Bioanalizador 2100 con el kit de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies).

Results (Resultados): Extracción automatizada de gDNA

Para la extracción de ADN genómico se utilizaron muestras de sangre completa operando la estación de trabajo genómica híbrida dual Biomek i7. El ADN genómico se cuantificó utilizando NanoDrop One (figura 1) y distribución del tamaño (figura 2) y los números de integridad del ADN (DIN) se calcularon con la TapeStation de Agilent utilizando ScreenTape genómico (tabla 1).

Póster genómico Concentración de gADN NanoDrop Figura 1

Figura 1: Concentración y pureza del gDNA determinadas con NanoDrop

Póster genómico TapeStation de Agilent Figura 2

Figura 2: Distribuciones de tamaño del gDNA para 16 muestras seleccionadas al azar de la TapeStation de Agilent

Donante  Tipo de tubo de sangre DIN
D6 EDTA 9,6
D6 Heparina 9,5
D6 Citrato 9,6
D7 EDTA 9,2
D7 Heparina 9,4
D7 Heparina 9,6
D7 Citrato 9,5
D8 EDTA 7,8
D8 EDTA 9,1
D8 Heparina 9,6
D8 Citrato 9,5
D8 Citrato 9,2
D9 EDTA 9,5
D9 Heparina 9,6
D9 Citrato 9,2

Tabla 1: DIN para 16 muestras seleccionadas al azar de la TapeStation de Agilent

Automatización Biomek Serie i

La plataforma Biomek Serie i representa el manipulador de líquidos automatizado más reciente de Beckman Coulter. El flujo de trabajo descrito a continuación se realizó en una Biomek i7 híbrida dual equipada con un receptáculo multicanal de 1200 µl y un receptáculo Span-8 de 1 ml. El instrumento fue equipado con un agitador orbital y un dispositivo peltier de agitación, y tenía la opción de un termociclador automatizado (ATC) Thermo Scientific integrado. También se puede integrar el termociclador Biometra TRobot en sustitución del ATC. El lanzador de métodos Biomek, combinado con el selector de opciones de método HTML y la configuración de material de laboratorio guiada, permiten sencillez de funcionamiento y flexibilidad en la programación de flujos de trabajo. Se realiza una comprobación final de la plataforma utilizando DeckOptix para reducir el número de costosos errores que se pueden efectuar durante la configuración.

Aislamiento de ADN de sangre completa fresca GenFind V3 Aislamiento de ADN de sangre completa congelada GenFind V3
Funcionalidad de la interfaz Biomek de póster genómico 

Results (Resultados): Preparación de la biblioteca NGS automatizada

Se prepararon 15 muestras de ADN genómico y un control de ADN genómico (ADN de referencia humano Coriell) en bibliotecas de secuenciación NGS utilizando la biblioteca Roche KAPA HyperPlus con la estación de trabajo Biomek i5 NGS. Las bibliotecas preparadas se analizaron con el bioanalizador Agilent 2100 utilizando un kit de ADN de alta sensibilidad (figura 3).

Póster genómico Bioanalizador Agilent 2100 Figura 3

Figura 3: Seguimiento del bioanalizador de 15 bibliotecas NGS preparadas a partir de muestras de gADN

Conclusiones

En conclusión, hemos demostrado que la automatización del kit de aislamiento de ADN de sangre y suero GenFind V3 en la estación de trabajo genómica Biomek i7 ofrece muestras de gADN de alta calidad que están listas para bibliotecas listas para secuenciación y aplicaciones NGS posteriores. Futuras instrucciones para la automatización de GenFind V3 incluyen la integración estandarizada del Thermo Scientific KingFisher™ Presto en la serie i para obtener una mayor entrada de muestras.

 

El kit Roche KAPA HyperPlus es solo para uso en investigación. No está destinado al uso en procedimientos de diagnóstico. https://sequencing.roche.com/en/legal.html

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