Automatización de un gradiente de densidad lineal para purificación de un complejo proteína-ligandos

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Dr. Chad Schwartz, científico de aplicaciones - Beckman Coulter, Inc., Indianápolis, IN 46268

Introducción

Las proteínas tienen una variedad de funciones, estructuras y mecanismos de acción celulares. De forma rutinaria, las proteínas se unen a otras biomoléculas, o ligandos, para completar una tarea. Los investigadores obtienen valiosos conocimientos sobre cómo funcionan las proteínas en un entorno celular mediante la purificación de proteínas unidas a su apropiado sustrato. Normalmente, los complejos de proteínas-ligandos se analizan más a fondo mediante crio-EM, NMR y/o cristalografía por rayos X para obtener información estructural. Sin embargo, la purificación de complejos de proteínas-ligandos sigue siendo difícil debido a la falta de técnicas de separación robustas y reproducibles.

Los gradientes de densidad de velocidad zonal lineales (también conocidos como continuos) se forman de diversas maneras, pero el proceso siempre comienza con la estratificación de un gradiente discontinuo (también conocido como de paso). En la técnica más popular, se pipetea inicialmente una alícuota de una solución menos densa en un tubo de centrifugación y sucesivamente se introducen soluciones más densas en el fondo del tubo utilizando una jeringa larga para no alterar la capa anterior, dejando una interfaz nítida entre las diferentes capas de densidad. Otro enfoque es formar capas con soluciones cada vez menos densas de manera delicada sobre las soluciones más densas. Para generar un gradiente continuo a partir de un gradiente discontinuo, se utilizan 3 técnicas principales: 1) incubación entre 4˚ y 8˚ C durante 16 horas o durante la noche; 2) batido en una centrífuga a una velocidad y duración establecidas; o 3) uso de un marcador de gradiente comercial que hace girar el tubo en un ángulo específico a una velocidad y duración determinadas. En todas estas técnicas, la solución se difunde de tal manera que se produce un aumento gradual de la densidad desde la parte superior a la parte inferior del tubo. Ambas técnicas de estratificación son tediosas y consumen mucho tiempo y no suelen ser reproducibles entre investigadores, lo que requiere práctica y muchísima paciencia para generar interfaces sólidas entre densidades.

Aquí presentamos un método simplificado: el cuarto para prepara gradientes. Para eliminar la variabilidad del usuario, la estación de trabajo Biomek 4000 de Beckman Coulter proporciona resultados consistentes y reproducibles en la estratificación de gradientes discontinuos (consulte las notas de aplicación DS-18638A, IB-18433A y CENT-447APP08.14-A). La estación de trabajo Biomek 4000 ofrece facilidad de uso y una precisión excepcional en la manipulación de líquidos. Además, la estación de trabajo Biomek 4000 puede equiparse fácilmente con un posicionador de material automatizado (ALP) con peltier estático de refrigeración que proporciona una plataforma de incubación incorporada para la formación de gradientes lineales durante la noche sin necesidad de refrigerador o una sala fría.

Después de la centrifugación, los gradientes suelen fraccionarse perforando la parte inferior de un tubo y recogiendo un número específico de gotas por alícuota, o mediante pipeteo manual desde el menisco. Existen sistemas disponibles en el mercado que son capaces de fraccionar los gradientes de forma automática, pero estos sistemas son normalmente costosos y no son compatibles con todos los tipos de tubos. Dado que la estación de trabajo Biomek 4000 ofrece soluciones para la manipulación precisa de líquidos, el instrumento fue probado para determinar si también era adecuado para fraccionar un gradiente de sacarosa.

La ATPasa de phi29 y el ligando de ADN

Los virus de ADN bicatenario (bc) empaquetan su ADNbc genómico en una capa de proteína preformada, llamada procapsid, durante la maduración.1,2. Este proceso entrópicamente desfavorable es realizado por un nanomotor que utiliza ATP como fuente de energía.3-6. El bacteriófago phi29 es un fago muy investigado debido a su diseño simplista, compuesto por una enzima de empaquetamiento de ATPasa, considerada gp16, una proteína portal conectora (gp10) y un ARN de empaquetamiento (ARNp). Guo et al.7 propuso en primer lugar que el mecanismo mediante el cual el ADNbc se empaqueta en el procapsid se asemeja a la acción de otras proteínas AAA+ (ATPasas asociadas con diversas actividades celulares) utilizando ATP como energía. Recientemente, se ha determinado que la gp16 utiliza un mecanismo de acción secuencial con ADNbc y ATP para efectuar el empaquetado.8 Además, se ha validado que la gp16 existe como un hexámero (de manera similar a otras proteínas AAA+) en el motor de empaquetado vírico9 y que existe cooperatividad entre la ATPasa y la ATP, generando un estado de alta afinidad para el ADNbc después de unirse a un sustrato ATP no hidrolizable, γ-S-ATP.10 Se propuso un mecanismo revolucionario para el empaquetado del ADN10 que posteriormente se corroboró.11-13 Este motor es de particular interés, ya que se ha demostrado ampliamente que se utiliza en varias aplicaciones de nanotecnología.14-17

En el estudio de este motor, fue fundamental investigar cómo ciertos componentes interactúan con otros en las condiciones celulares para comprender mejor el mecanismo y la biología del fago. Uno de dichos ensayos implicó aislar el complejo gp16/ADNbc mediante centrifugación de velocidad-zonal. En el experimento anterior, publicado en Nucleic Acids Research,8, los complejos se purificaron en un gradiente de sacarosa al 5–20 % en un rotor SW-55 de Beckman Coulter a 35 000 rpm y se sometieron a un posterior análisis cinético para determinar la tasa de hidrólisis de la ATP. También se realizaron experimentos adicionales en el complejo purificado, obteniéndose valiosa información que permitió a los investigadores dilucidar el mecanismo de empaquetamiento del ADN en maduración de fagos de phi29.

En el ejemplo que sigue, se ensaya la purificación del complejo gp16/ADNbc imitando el experimento publicado anteriormente, pero en un rotor más grande y utilizando un método de estratificación y fraccionamiento automatizado en la estación de trabajo Biomek 4000.

Materiales

La sacarosa se diluyó al 5 % y 20 % (p/v) utilizando un tampón de dilución (50 mM de NaCl, 25 mM de Tris pH 8,0, glicerol al 2 %, Tween-20 al 0,001 %, 2 mM de MgCl2, 0,15 mM de γ-S-ATP) y se creó el gradiente ya sea de forma manual estratificando solución al 5 % sobre la solución al 20 % con una pipeta, o bien de forma automática con la estación de trabajo Biomek 4000. Las soluciones se incubaron a una temperatura de 4 ˚C durante la noche en un refrigerador o en el ALP de peltier prerrefrigerado de la estación de trabajo Biomek 4000. En el método de la estación de trabajo Biomek 4000, se colocaron en la cubierta tubos cónicos de 15 ml que contenían una solución de sacarosa al 5 % o 20 % en una rejilla de retención junto con un peltier estático preenfriado que contenía hasta seis tubos de centrífuga de polipropileno Beckman Coulter de 13,2 ml (Ref. 331372). Primero se solicitó a la estación de trabajo Biomek 4000 que añada 5,5 ml de solución al 5 % en el fondo del tubo de centrífuga utilizando una herramienta P1000SL en alícuotas de 916,6 μl. A continuación, se solicitó a la estación de trabajo Biomek que añada 5,5 ml de sacarosa al 20 % debajo de la solución al 5 % en el fondo del tubo. Las puntas preesterilizadas Span-8 P1000 (Ref. B01124) de Beckman Coulter son largas y cilíndricas, lo que provoca daños mínimos en la interfaz de sacarosa durante este paso. Luego se configuró el ALP peltier para que mantenga la temperatura durante la noche a fin de permitir que la sacarosa generase un gradiente lineal.

La gp16 se rediseñó en 2009 para que contenga un grupo fluorescente, proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), el cual no afectó a la actividad ni al plegado de la proteína18, pero que sí proporcionó un marcador de fácil identificación para ensayos in vitro y de moléculas individuales. Además, se ha demostrado que el eGFP-gp16 se une de manera no específica al ADNbc, y las etiquetas fluorescentes (como la cy3) son fácilmente conjugables para una mayor identificación. El ADNbc conjugado ultrapurificado de 40 bp con cy3, que se compró a Integrated DNA Technologies (IDT), se resuspendó en DEPC-H2O. El γ-S-ATP se compró a Roche Diagnostics.

Las muestras se prepararon mezclando eGFP-gp16, cy3-ADNbc y γ-S-ATP en concentraciones finales de 1 μm, 250 nm y 1,25 mm, respectivamente. Las muestras se agregaron con suavidad a la parte superior del gradiente como para no interrumpir el gradiente formado, se equilibraron y, a continuación, se colocaron en una ultracentrífuga Beckman Coulter Optima XPN, centrifugando durante 7 horas a 40.000 rpm a 4˚C.

Las muestras se fraccionaron directamente desde la parte superior del tubo con una pipeta establecida a 250 μl en una microplaca opaca, o utilizando el nivel de líquido de la estación de trabajo Biomek 4000 se controló el menisco y automáticamente se transfirieron fracciones del mismo volumen a la microplaca en la plataforma. En el método de la estación de trabajo Biomek 4000, se colocó una gradilla que contenía los tubos de centrifugación en la cubierta junto con una microplaca de fondo negro. Se usaron puntas P1000 para fraccionar 250 μl de la parte superior del menisco y se añadieron directamente a pocillos consecutivos de la microplaca de 96 pocillos. Según los parámetros definidos por el usuario para la geometría del tubo, la estación de trabajo Biomek4000 puede realizar un seguimiento preciso del nivel de líquido del tubo a medida que se eliminan fracciones. Las fracciones fueron analizadas posteriormente por un dispositivo de detección multimodo SpectrAmax® i3 de MolecularDevices, tanto las longitudes de onda GFP como cy3 (488 nm y 540 nm, respectivamente) y los datos se exportaron a un archivo Microsoft®Excel® para su análisis. Los datos fueron transferidos a Origin Pro v9.0 para su trazado.

Resultados

Los datos del lector de microplacas SpectrAmax® i3 de Molecular Devices se trazaron y superpusieron para ambas longitudes de onda y métodos en la Figura 1. La dirección de la sedimentación es de izquierda a derecha en los gráficos, según se extrajeron las fracciones de la parte superior del tubo. La línea negra de cy3 presenta el ADN–cy3 y la línea roja de GFP denota GFP-gp16. En la Figura 1a, la técnica manual de superposición y fraccionamiento fue capaz de resolver la proteína y ADN libre (fracción 2-6) del complejo proteína-ADN (fracciones 17-32). Utilizando la estación de trabajo Biomek 4000 para la superposición y fraccionamiento (Figura 1b), nuevamente la proteína libre y el ADN libre (fracciones 3-6) se separaron del complejo gp16/ADN (fracciones 17-27). Sin embargo, en la técnica de Biomek, existen dos picos distintos en la región compleja, especialmente evidentes mirando la señal cy3. Las fracciones 16-21 son claramente un pico independiente de las fracciones 24-27, lo que sugiere que existen dos conformaciones o estados oligoméricos de la proteína unidos al ADN. De hecho, este fenómeno ha sido discutido anteriormente en un documento virológico reciente10 y es un hallazgo de importancia profunda que proporciona información relevante al mecanismo de empaquetamiento. Se cree que el gp16 une primero a los ADNbc un dímero y luego se ensambla en un hexámero para completar la función de empaquetamiento. Se plantea la hipótesis de que las fracciones 16-21 representan el estado dimérico, mientras que las fracciones 24-27 consisten en el hexámero.

Los mismos datos se representaron en la Figura 2 pero se compararon los 2 métodos en gráficos individuales para cada señal. La forma general de la gráfica es muy similar, lo que sugiere que el método de automatización es robusto y puede sustituir el método manual histórico. De nuevo, parece que la resolución es mayor para el método de la estación de trabajo Biomek 4000 (línea roja), lo que puede atribuirse a mejores técnicas de pipeteo y menos movimiento físico después de la superposición de capas. La desviación estándar también es comparable entre ambas técnicas, lo que indica reproducibilidad.

Fig. 1a y 1b. Preparación manual frente a preparación de la estación de trabajo Biomek 4000 de un gradiente de sacarosa lineal del 5 al 20 %.
Figura 1a y 1b: Preparación manual frente a preparación de la estación de trabajo Biomek 4000 de un gradiente de sacarosa lineal del 5 al 20 %.
Fig. 2a y 2b. Imágenes superpuestas de diferentes técnicas de preparación para eGFP-gp16 (a) y cy3-ADNbc (b).
Figura 2a y 2b: Imágenes superpuestas de diferentes técnicas de preparación para eGFP-gp16 (a) y cy3-ADNbc (b).

 

Deliberación

La purificación de los complejos proteína-ligando es importante para comprender los procesos biológicos. A menudo, los complejos purificados se utilizan en análisis posteriores, como en la obtención de imágenes de alta resolución, secuenciación o cristalografía para el descubrimiento de tratamientos basados en proteínas. En el ejemplo anterior, el complejo gp16/ADNbc purificado reveló el mecanismo de una función biológica única conocida como empaquetamiento del ADN en un bacteriófago. La falta de un método sólido y reproducible para la purificación de proteínas-ligandos ha dificultado la investigación durante muchos años. La cromatografía tiene varias Fig. 2a y 2b. Imágenes superpuestas de diferentes técnicas de preparación para eGFP-gp16 (a) y cy3-ADNbc (b). ventajas; sin embargo, a menudo, el método requiere grandes factores de dilución, incompatibilidades de proteínas y baja resolución. La centrifugación de gradiente de densidad permite que el usuario modifique rápidamente parámetros, ofreciendo separaciones eficientes, y se rige por las leyes de la termodinámica.

Aquí describimos un método automatizado para la purificación de proteínas-ligandos por centrifugación zonal. Es importante tener en cuenta que este método es adecuado para casi todas las proteínas, después de optimizar el tiempo de centrifugado, la velocidad y las condiciones de gradiente. El protocolo ofrece ventajas significativas con respecto a las preparaciones manuales, como las siguientes:

Reproducibilidad

El error humano es común en una serie de experimentos científicos y se ve agravado en las tareas difíciles, como la puesta en marcha y fraccionamiento de un gradiente de densidad por parte de diferentes usuarios de un grupo de laboratorio. La superposición de un gradiente manualmente, usando el método de aguja y jeringa o mediante pipeta, que requiere una mano muy estable y paciencia. Al automatizar el proceso, la estación de trabajo Biomek 4000 proporciona una interfaz distinguible y una fracción consistente cada vez. Ya no habrá que preocuparse por añadir muestras al mismo pocillo dos veces o por contar manualmente las gotas irregulares de la parte inferior del tubo de la centrífuga. Además, el enfoque automatizado para la superposición de capas incluye un paso de Peltier en frío que reduce el movimiento de los tubos que se produce al trasladar los gradientes a la sala fría o al refrigerador. Esta ventaja es importante ya que este movimiento a menudo provoca que la interfaz se vuelva turbia.

Facilidad de uso

El fraccionamiento y superposición manual de un gradiente de densidad es un trabajo laborioso y tedioso. Deje que Biomek se encarga de la parte más dura del trabajo simplemente pulsando un botón.

Enfoque de “poner en marcha e irse”

Los métodos automatizados tomaron justo el mismo tiempo en la superposición y el fraccionamiento de gradiente que al hacerlo manualmente. De hecho, la superposición de 2 gradientes duró menos de 20 minutos y el fraccionamiento de 2 tubos se realizó en menos de 50 minutos. La diferencia está en que un investigador puede simplemente poner en marcha la máquina e irse, pudiendo realizar otros trabajos mientras se ejecutan los métodos. Por último, la línea de productos automatizada de Biomek es capaz de integrarse con diversos tipos de equipo de análisis posteriores, incluidos lectores de microplacas como la plataforma de detección multimodo SpectrAmax®i3 de Molecular Devices. Esto permite a los investigadores centrarse en asuntos más importantes, como el análisis de datos y la redacción de concesiones.

Reconocimientos

El autor desearía dar las gracias al Dr. Peixuan Guo, catedrático de Nanobiotecnología, y Zhengyi Zhao del Colegio de Farmacia de la Universidad de Kentucky por proporcionar materialesy orientación.

Referencias

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