Caracterizando la insulina como producto biofarmacéutico usando el ultracentrifugado analítico

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Chad Schwartz Ph.D., Dean Clodfelter, M.S. | Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN 46268

Resumen

La insulina es un fármaco bien caracterizado que se usa para tratar la diabetes. Se han investigado un gran número de formulaciones de insulina para desarrollar la entrega temporal óptima adecuada para las necesidades de los pacientes. Además, se ha desarrollado una serie de análogos de la insulina, como la insulina glargina y la insulina LySpro (Humalog), que se comercializan como derivados para uso inmediato a la hora de la comida y con una liberación más sostenida. Con la divulgación normativa de varias directrices sobre biosimilares, un buen número de empresas biofarmacéuticas están buscando activamente versiones de estos productos comercializados para abordar las necesidades de pacientes en este mercado multimillonario. La biodisponibilidad de todos estos productos depende en gran medida no solo de la estructura principal del producto análogo, sino también de la formulación. Aquí, se investiga el ultracentrifugado analítico (AUC) como herramienta potencial para analizar la estructura de mayor orden de la insulina en condiciones de formulación típicas. Se utilizó AUC para sondear el efecto de la concentración de insulina, la adición de zinc y agente quelante de zinc EDTA en monómero, dímero y la formación de hexámero de la normativa de referencia de insulina humana de USP. El hexámero de zinc mostró dependencia de la concentración de EDTA con especies de dímero y monómero incrementadas a concentraciones de EDTA más altas. Los métodos que se detallan en este punto destacan el uso del Beckman Coulter ProteomeLab XL-I para caracterizar las sustancias biofarmacéuticas en condiciones variantes para el desarrollo de formulaciones.

Introducción

En 2012, 29,1 millones de estadounidenses, o el 9,4 % de la población, tenían diabetes de tipo 1 o tipo 2 según la Asociación Estadounidense de Diabetes. Esta enfermedad fue la séptima causa de muerte en Estados Unidos en 2010 con 69.071 muertes1. El tratamiento principal para la diabetes tipo 1 es el tratamiento diario con insulina, ya que estos pacientes son incapaces de producir suficiente insulina por sí mismos. Normalmente, los pacientes con diabetes tipo 1 requieren la administración de varias inyecciones de insulina cada día a la hora de la comida. Sin embargo, incluso cuando se administra correctamente, las inyecciones de insulina no replican el perfil de acción natural de la insulina, y por tanto se han desarrollado (y se están desarrollando actualmente) sustancias análogas para mejorar la eficacia. Gran parte de la investigación existente sobre el perfil de acción de la insulina depende de la estequiometría de la molécula en las condiciones de formulación y de dilución tras la inyección en el cuerpo humano.

Las empresas biofarmacéuticas utilizan muchos métodos habitualmente para medir el tamaño de las partículas y la heterogeneidad en un estado de solución. Las funciones de AUC definen el tamaño de las partículas, la heterogeneidad y la relación de fricción mediante la manipulación de la ecuación de Lamm, que describe las partículas a medida que se precipitan en un líquido bajo fuerza. Se ha indicado previamente que AUC mide el impacto de la formulación sobre el coeficiente de sedimentación de la insulina2,3 pero nunca se ha demostrado empíricamente, evaluando el impacto del zinc y de un agente quelante en una estructura de más alto orden.

Materiales

Se adquirió fosfato sódico dibásico, cloruro de zinc, EDTA y glicerol de Fischer Scientific. Se adquirió hidrócido de sodio de Fluka y ácido clorhídrico de BDH Chemicals. Se adquirió de Fisher Scientific insulina que cumple con la norma de referencia para insulina humana de la Farmacopea Estadounidense (USP).

De Beckman Coulter, Inc. se adquirió lo siguiente: ProteomeLab XL I, celdas analíticas de velocidad de sedimentación de dos sectores, ventanas de cuarzo, un rotor de 60 Ti, un rotor de 50 Ti y un soporte de par motor.

Métodos

Ajuste de la concentración de insulina no formulada: La insulina se resuspendió a 50 mg/ml en 0,04 N HCl y se diluyó a las respectivas concentraciones. También se creó un tampón de referencia que coincide con el solvente de muestra, vacío de insulina. 420 μl de referencia y muestra se cargaron en una celda analítica de 2 sectores, alineada con un rotor de 60 Ti, y se equilibró a 20 ˚C durante más de 1 hora. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 60.000 rpm, a 20 ˚C, con 4 horas de escaneado a Abs280nm en modo continuo.

Ajuste de la concentración de insulina formulada: La insulina se resuspendió a 50 mg/ml en 0,04 N HCl y se diluyó a las respectivas concentraciones y se formuló con 150 μM de ZnCl2, 16 mg/ml de glicerol, 1,9 mg/ml de fosfato sódico dibásico y 2,2 mm de NaOH. También se creó un tampón de referencia que coincide con el solvente de muestra, vacío de insulina. 420 μl de referencia y muestra se cargaron en una celda analítica de 2 sectores, alineada con un rotor de 60 Ti, y se equilibró a 20 ˚C durante más de 1 hora. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 60.000 rpm, a 20 ˚C, con 4 horas de escaneado a Abs280nm en modo continuo.

Ajuste de la concentración de zinc: La insulina se resuspendió a 50 mg/ml en 0,04 N HCl y se diluyó a 4 mg/ml formulada con varias concentraciones de ZnCl2, 16 mg/ml de glicerol, 1,9 mg/ml de fosfato sódico dibásico y 2,2 mm de NaOH. También se creó un tampón de referencia que coincidiese con el solvente de muestra, vacío de insulina. 420 μl de referencia y muestra se cargaron en una celda analítica de 2 sectores, alineada con un rotor de 60 Ti, y equilibrada a 20 ˚C durante más de 1 hora. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 60.000 rpm, a 20 ˚C, con 4 horas de escaneado a Abs280nm en modo continuo. El rotor se detuvo pero se dejó bajo al vacío a 20 ˚C. 15 días después, se retiraron las celdas del rotor, se agitaron vigorosamente y se volvieron a procesar en las mismas condiciones.

Ajuste de la concentración de EDTA: La insulina se resuspendió a 50 mg/ml en 0,04 N HCl y se diluyó a 2 mg/ml formulada con 15 μm de ZnCl2, 16 mg/ml de glicerol, 1,9 mg/ml de fosfato sódico dibásico y 2,2 mm de NaOH. Se añadieron diferentes concentraciones EDTA al producto formulado y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. También se creó un tampón de referencia que coincidiese con el solvente de muestra, vacío de insulina. 420 μl de referencia y muestra se cargaron en una celda analítica de 2 sectores, alineada con un rotor de 50 Ti, y equilibrada a 20 ˚C durante más de 1 hora. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 50.000 rpm, a 20 ˚C, con 5 horas de escaneado a Abs280nm en modo continuo.

Análisis de datos†: Los datos se extrajeron del controlador AUC y se importaron a SEDFIT 14,7 g4 (www.analyticalultracentrifugation.com). Los datos de absorbancia se analizaron según una distribución continua c(s) de especies de sedimentación utilizando un intervalo de confianza de regularización entrópica máxima de 0,68. En todos los casos, se observaron coincidencias con desviaciones de valor cuadrático medio que oscilaban entre 0,0016 y 0,0093 unidades de absorbancia. El volumen parcial específico de insulina se calculó basándose en la composición de aminoácidos en SEDNTERP5 (http://sednterp.unh.edu); la densidad ρ y la viscosidad η para cada tampón de formulación también se calcularon en SEDNTERP. Se usó un modelo c(s) en el que la relación de fricción f/fo se dejó flotar y el volumen específico parcial se refinó. Los datos se extrajeron a GUSSI (http://biophysics.swmed.edu/MBR/software.html) y se representaron para c(s) con una restricción mínima del valor de s = 0,3 S.

Figura 1. Velocidad de sedimentación c(s) de insulina en 0,04 N HCl solamente.
Figura 1: Velocidad de sedimentación c(s) de insulina en 0,04 N HCl solamente.

Resultados y deliberación

La insulina humana USP se diluyó a tres concentraciones diferentes en 0,04 N HCl y se cargó en 2 celdas AUC de velocidad de sedimentación de 2 sectores. El análisis reveló que las tres concentraciones se centraron en 1,2 S en el análisis a través del popular software SEDFIT (fig. 1). Los valores de c(s) se dejaron sin normalizar para mostrar el cambio en la señal con una disminución de la concentración. El valor obtenido de 1,2 S es más probable que represente el de la insulina monomérica, en concordancia con Pohl, et.al.5, coherente con el comportamiento de monómero6,7.

En condiciones de formulación típicas5, la insulina se vio afectada y se analizó para determinar el coeficiente de sedimentación. Aquí, la insulina tenía un s20,w de entre 2,95 y 3,1 S, pero a 4,0 mg/ml, una especie menor a 2,12 S emergió a un valor de peso de señal del 8,3 % del material de sedimentado general (fig. 2). Este nuevo pico es más probable que represente la insulina dimérica. Curiosamente, la proteína se disoció a la concentración máxima, sugiriendo que el ensamblaje no depende de la concentración; en su lugar, la disociación es más probable que se produzca a partir de condiciones de no saturación de uno de los excipientes.

Figura 2. Velocidad de sedimentación normalizada c(s) del ajuste de concentración de la insulina formulada. 0,25 mg/ml (negra), 1,0 mg/ml (azul) y 4,0 mg/ml (verde) se analizaron para determinar el coeficiente de sedimentación tras la formulación.
Figura 2: Velocidad de sedimentación normalizada c(s) del ajuste de concentración de la insulina formulada. 0,25 mg/ml (negra), 1,0 mg/ml (azul) y 4,0 mg/ml (verde) se analizaron para determinar el coeficiente de sedimentación tras la formulación.
Para explorar el efecto, se sondearon la concentración de zinc en el tampón de formulación y el impacto en el coeficiente de sedimentación. A una concentración fija de insulina, la adición de zinc empujó la formación de complejo hasta el hexámero alrededor de 3,0 S (fig. 3A). Por lo tanto, el zinc es crítico para la formulación adecuada de hexámero y a alta concentración de insulina, la cantidad de zinc ya no se encuentra a niveles de saturación, lo que conduce a una especie más pequeña, probablemente representativa de un dímero de insulina. Para determinar si el efecto dependía del tiempo, las mismas formulaciones se dejaron en las celdas analíticas durante 15 días a 20 °C y en vacío, y se sedimentaron por segunda vez. Los resultados fueron los mismos para ambos centrifugados, lo que sugiere que la insulina hexamérica es estable durante al menos 15 días después de la formulación (fig. 3B).

 

Figura 3. Velocidad de sedimentación normalizada c(s) del ajuste de concentración de la insulina formulada.   Figura 3. Se analizaron 0,25 mg/ml (negra), 1,0 mg/ml (azul) y 4,0 mg/ml (verde) para determinar el coeficiente de sedimentación tras la formulación.
Figura 3: Velocidad de sedimentación normalizada c(s) del ajuste de concentración de la insulina formulada. 0,25 mg/ml (negra), 1,0 mg/ml (azul) y 4,0 mg/ml (verde) se analizaron para determinar el coeficiente de sedimentación tras la formulación.

Finalmente, para confirmar la función del zinc en la formación de insulina hexamérica, el EDTA se ajustó en la formulación para actuar como un quelante. Aquí, tanto la concentración de insulina como la de zinc se fijaron a condiciones estables de hexámero y se añadió EDTA y se incubó durante 20 minutos. A concentraciones crecientes de EDTA, la insulina hexamérica se disoció en monómeros y dímero (fig. 4). A 75 μM EDTA, aproximadamente el 11 % del complejo hexamérico se había disociado en monómero (tabla 1). A 150 μM, un 15 % adicional se disoció hasta una señal de peso monomérico total del 26,4 %. A 300 μM, las especies hexaméricas se disolvieron por completo en aproximadamente un 60 % de monómero y un 40 % de dímero. Finalmente, a 600 μM, existía insulina con aproximadamente un 68 % de monómero y un 32 % de dímero.

Figura 4. Velocidad de sedimentación c(s) del ajuste de EDTA con concentración fija de insulina.  
Ajuste de zinc Hexámero Dímero Monómero
EDTA de 0 μM 100 % (3,201 S) N/D N/D
EDTA de 75 μM 88,88 % (3,015 S) N/D 11,11 % (1,373 S)
EDTA de 150 μM 73,59 % (2,949 S) N/D 26,41 % (1,400 S)
EDTA de 300 μM N/D 40,63 % (2,258 S) 59,37 % (1,52 S)
EDTA de 600 μM N/D 31,99 % (2,262 S) 68,01 % (1,551 S)
Figura 4: Velocidad de sedimentación c(s) del ajuste de EDTA con concentración fija de insulina.   Tabla 1: Promedio de la señal de peso de las especies oligoméricas de insulina después del tratamiento con EDTA.

Conclusiones

La insulina es un fármaco bien caracterizado creado por muchos fabricantes diferentes en todo el mundo y se ha utilizado para tratar la diabetes durante más de 80 años. Hoy en día, las empresas biofarmacéuticas están llevando a cabo grandes esfuerzos para crear derivados de la insulina y formulaciones novedosas para mejorar la eficacia, los métodos de administración y los perfiles de acción temporal. En el desarrollo futuro de análogos de la insulina, el efecto de los excipientes como el zinc deberá considerarse en la etapa de ensamblaje del fármaco. Estos efectos se pueden sondear con varias técnicas analíticas.

Los niveles de agregación de insulina se han controlado tradicionalmente utilizando el método SEC de monografía de insulina humana. Este método se utiliza para medir agregados covalentes de la insulina como los dímeros covalentes que son resultado de la reacción de condensación de aminas libres en la terminación N o en las lisinas libres. La adición por agregación covalente puede producirse mediante la interrupción y la reformación de los enlaces de disulfuro. Sin embargo, este método no puede medir los niveles relativos de agregados no covalentes como la insulina hexamérica a los niveles de monómero. Estos agregados no covalentes se interrumpen durante el procedimiento de preparación y análisis de la muestra de SEC. El AUC, tal como se demuestra en esta nota de aplicación, es útil para evaluar el nivel de agregados no covalentes como el hexámero de insulina. Aquí, hemos demostrado un enfoque de futuro para caracterizar la estructura de orden superior de un producto biofarmacéutico común con un desarrollo mínimo. La mayoría de los métodos de orden más alto, como el SEC, requieren adulterar la muestra a través de grandes diluciones o interacciones de matriz-columna que pueden alterar aún más el estado de agregación. Además, aunque el SEC es la forma más adecuada de medir los agregados covalentes, el rango de masas molares del AUC va aproximadamente de pocos centenares a 109 daltons, un intervalo que supera la capacidad típica de la SEC analítica7. Por último, el AUC puede generar información cuantitativa sobre las propiedades de las proteínas, incluido el peso molecular, la forma, las propiedades de la solvencia8, las modificaciones post-translacionales9, y las fluctuaciones conformacionales10 a concentraciones aproximadas de 40-50 mg/ml11, lo que posiciona la herramienta como técnica independiente u ortogonal al método biofarmacéutico tradicionalmente utilizado de SEC para estudiar la biosimilitud, agregación, comparabilidad entre lotes y desarrollo de formulación7.

†Los resultados generados a partir de los softwares enumerados en esta sección no están garantizados. Consulte las herramientas de software específicas de las renuncias individuales.

Referencias

  1. Asociación Estadounidense de Diabetes: http://www.diabetes.org/diabetes-basics/statistics/
  2. Richards, J.P., Stickelmeyer, M.P., Flora, D.B., Chance, R.E., Frank, B.H., DeFelippis, M.R. Self association properties of monomeric insulin analogs under formulation conditions. Pharmaceutical Research. (1998) 15(9): 1434 1441.
  3. Pohl, R., Hauser, R., Li, M., De Souza, E., Feldstein, R., Seibert, R., Ozhan, K., Kashyap, N., Steiner, S. Ultra rapid absorption of recombinant human insulin induced by zinc chelation and surface charge masking. J Diabetes Science & Technology. (2012) 6(4): 755 763.
  4. Schuck P. Size distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biofímacos. J. (2000) 78:1606-19.
  5. Cole J.L., Lary J W, Moody T P and Laue T M Analytical ultracentrifugation: sedimentation velocity and sedimentation equilibrium. Methods Cell Biol. (2008) 84:143–79.Fredericq E, Neurath H. The interaction of insulin with thiocyanate and other anions. the minimum molecular weight of insulin. J Am Chem Soc. (1950) 72:2684-91.
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