Evite los errores al automatizar el recuento de viabilidad celular para el control de calidad biofarmacéutico

Resumen

Si se utilizan células para fabricar un producto farmacológico terapéutico o pruebas de eficacia farmacológica en farmacología, la medición de la viabilidad y concentración de las células con exactitud y con una buena reproducibilidad es crucial. Los contadores de células automatizados cuentan las células según la tecnología que utilizan y su configuración individual, y esto podría producir resultados que varíen ampliamente en comparación con otros sistemas automatizados y debido a la técnica manual común de utilizar un microscopio y un hematocitómetro. Por ejemplo, algunas personas solo incluyen células como "viables" al calcular la concentración de células si las células son mayores que un determinado diámetro e ignoran todas las células más pequeñas, incluso si las otras características de las células pequeñas indican que son viables. Posteriormente en este documento mostraremos un ejemplo de cómo la identificación de células viables únicamente a través de diámetro mínimo puede introducir una variabilidad de aproximadamente el 33 % en la concentración de células notificadas. En este documento se describe cómo evitar estos errores comunes cuando un usuario está adoptando un nuevo método automatizado de recuento celular.

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Introducción

Para la producción de proteínas terapéuticas, la concentración de células correctas en el biorreactor es crucial, tanto para garantizar el máximo rendimiento como para evitar la sobresaturación como consecuencia de la muerte celular programada (apoptosis). Para pruebas de eficacia farmacológica en farmacología, es crucial lograr que la concentración de células en cada muestra de prueba sea consistente, de manera que los resultados de la prueba de eficacia del fármaco no se vean afectados por la posible variabilidad de la viabilidad celular y la concentración en las muestras. En ambos casos, no existe una forma “correcta” de identificar las células. Los usuarios optimizan sus procesos basándose en su propia técnica de recuento de células. Algunas personas solo cuentan las células como "viables" si son mayores que un determinado diámetro e ignoran todas las células más pequeñas aunque parezcan ser viables. Más adelante en este documento, mostraremos cómo la identificación de células viables únicamente por diámetro mínimo puede introducir una variabilidad de un 33 % en la concentración de células notificada. Otro ejemplo: algunas personas cuentan una aglomeración de células como si solo fuera una célula, mientras que otras tratan de contar las células individuales en la aglomeración.

Al pasar a un método automatizado de recuento celular, es importante considerar cómo el sistema automatizado diferencia las células viables de las células no viables y los residuos celulares, y qué impacto puede tener esto en su proceso.

¿Cuál es la respuesta “correcta”?

No hay “respuesta correcta” al contabilizar las células. La mayoría de personas siguen las directrices indicadas en EP2.7.291 y en USP<1046>2; ambas directrices describen la contabilización de células viables utilizando el método de exclusión de colorante y sugieren que el azul tripano es un colorante adecuado. Probablemente la técnica más común es el método manual utilizando la diapositiva de hematocitómetro y un microscopio. La variación en los resultados de usuario a usuario puede ser muy alta con el método de hematocitómetro manual3, haciendo que un método automatizado sea atractivo. Sin embargo, es importante tener en cuenta cómo el método automatizado identifica y cuenta las células para comprender el impacto en el proceso si los resultados son diferentes entre el método manual y el método automatizado.

Fuentes de variabilidad en el método de hematocitómetro manual

Hay varios pasos en el método de hematocitómetro manual. Cada una puede dar lugar a variabilidad y debe tenerse en cuenta al pasar a un método automatizado:

  1. Pipeteo preciso
  2. Ciclos de aspiración
  3. Cantidad de colorante
  4. Ciclos de mezcla de colorante
  5. Tamaño de las células
  6. Aglomeraciones

Método de exclusión de colorante de EP2.7.29 y USP <1046>

Figura 1. Método de exclusión de colorante de EP 2.7.29 y USP <1046>

El pipeteo preciso es crucial. El volumen del portaobjetos del hematocitómetro suele ser de 1 nl. Para informar de la concentración de células viables/ml, el recuento de células visto a través del microscopio debe multiplicarse por un factor de 100 000 para convertir de nl a ml, por lo que cualquier pequeño error en el volumen de pipeteo, y por lo tanto en las células dispensadas en la diapositiva, se magnificará enormemente cuando se calcule la concentración por ml.

La aspiración puede ser útil para volver a suspender las células y deshacer las aglomeraciones. Sin embargo, las técnicas varían dependiendo de los usuarios y la resuspensión y la forma de deshacer los grumos varían. Además, algunas células son particularmente delicadas y la aspiración excesiva puede romper de hecho las membranas de las células viables, lo que permite que el colorante penetre y por lo tanto provoca un recuento inadecuado.

La adición inexacta de colorante afectará a la exactitud del cálculo final de la concentración celular de la misma manera que las variaciones en el volumen mediante el pipeteo inexacto de la muestra, ya que el colorante actúa de forma eficaz como diluyente de muestras. Al mismo tiempo, la variación en la concentración del colorante puede afectar a la penetración efectiva del colorante en las células muertas y en proceso de morir.

De la misma manera, la variedad en el número de ciclos de mezcla de colorante puede tener un efecto sobre la penetración del colorante en las células muertas y en proceso de morir, simplemente porque hace falta tiempo para que el colorante penetre en las células muertas y las variaciones en los ciclos de mezcla implican que las células estén expuestas al colorante durante diferentes periodos de tiempo.

En casos en los que la salud de las células viables tiene un gran impacto en los experimentos de farmacología o en el rendimiento de las proteínas terapéuticas, muchos usuarios solo contarán las células como viables cuando son mayores que un determinado tamaño. Por lo tanto, la exclusión de colorante no es normalmente el único criterio a la hora de definir la viabilidad celular.

Por último, algunos usuarios intentan identificar y contar todas las células individuales en una aglomeración de células, mientras que otros pueden contar la acumulación de células como si fuera solo una célula. Las pequeñas variaciones resultantes en el modo en que se cuentan las células pueden tener un gran impacto cuando se calcula la concentración por ml debido al gran factor de multiplicación entre nl y ml. El efecto de esto se hace particularmente perceptible conforme la concentración celular por ml aumenta en el biorreactor y las células tienden a aglomerarse más.

Cómo evitar los errores comunes

Como puede observarse, las pequeñas variaciones en la forma en que se cuentan las células utilizando el método del hematocitómetro manual pueden provocar variaciones grandes en la concentración calculada resultante de células viables por ml. Por este motivo, muchas personas implicadas en el recuento celular han cambiado a un recuento de células automatizado en búsqueda de resultados más reproducibles y, a su vez, mejores experimentos de farmacología controlados o producción de fabricación.

Sin embargo, hay algunos errores comunes: el contador automatizado debe ser capaz de ajustarse para identificar el número de células viables del mismo modo que el usuario lo haría cuando se utiliza un hematocitómetro y un microscopio. Lo mismo se aplica si se utiliza para sustituir otro sistema de recuento automatizado, es decir, se tiene que poder ajustar para identificar el número de células viables del mismo modo que el otro sistema de recuento automatizado que está sustituyendo. Si el nuevo contador de células automatizado no es lo suficientemente flexible en su método de recuento, producirá un resultado de concentración celular diferente al método anterior de la misma muestra de células, lo que posiblemente afectara a los resultados de los experimentos de farmacología o a la producción.

En la Figura 2 a continuación, el contador de células automatizado utiliza imágenes y una serie de parámetros ajustables por el usuario para decidir qué células son viables y qué células no lo son. El contador permite al usuario revisar cada imagen tomada (en este caso, el analizador se configura para tomar 50 imágenes y realizar un promedio de los resultados). El contador de células identifica por el usuario qué células ha identificado como viables rodeándolas con un círculo verde. En las células no viables, los círculos son rojos.

Las células viables están rodeadas de un círculo verde y las que no son viables en rojo

Figura 2. Las células viables están rodeadas de un círculo verde y las que no son viables en rojo

También puede ver en el lado derecho de la captura de pantalla que el contador también calcula el recuento de células totales por ml y el recuento de células por ml de células viables totales para la imagen que se está revisando y como promedio de todas las imágenes tomadas.

Idealmente, el contador automatizado debe tener un amplio rango de ajuste para los siguientes atributos de célula:

a. Diámetro mínimo de célula
b. Diámetro máximo de célula
c. Brillo de la célula
d. Nitidez de la célula
e. Área/tamaño de punto de célula viable
f. Circularidad celular
g. Grado de desagrupación

Los ajustes a) y b) permiten al usuario decir el tamaño de las células que normalmente considerarían ser viables.

En la Figura 3 a continuación, las imágenes de células se han analizado utilizando un diámetro celular mínimo para identificar células viables de diámetro de 6 micras.

Mínimo diámetro celular viable de 6 micras configurado en la pantalla de software

Figura 3. Mínimo diámetro celular viable configurado a 6 micras

Puede ver en la Figura 3 que, utilizando el diámetro mínimo de 6 micras, el contador cuenta células pequeñas como la que tiene un círculo rodeándola, que tiene un diámetro de tan solo 8,10 micras. Al utilizar este ajuste, el contador ha identificado un promedio entre las 50 imágenes de 10,73 x 106 células viables por ml.

Si ajustamos el diámetro mínimo a 15 micras de manera que el contador solo cuente las células más grandes como viables y pedimos al contador que vuelva a analizar el mismo conjunto de imágenes grabadas y nos notifique la nueva concentración de células calculada por ml, obtendremos una respuesta muy diferente (ver fig. 4 a continuación).

Se reanalizan las mismas imágenes con un diámetro de célula viable mínimo establecido en la pantalla de software a 15 micras

Figura 4. Se reanalizan las mismas imágenes con un diámetro de célula viable mínimo establecido

Comparando la fig. 4 a la Figura 3, se puede ver que el contador ya no ha identificado la célula más pequeña en la imagen número 50 como viable (no está rodeada en verde). El número total de células del mismo conjunto de imágenes que se contabilizan como viables se ha reducido, por lo que se reduce la concentración promedio de células viables calculadas para las 50 imágenes de 10,73 x 106 células viables por ml en la figura 3 a solo 7,23 x 106 células viables por ml en la figura 4, una diferencia de 3,5 x 106 células viables por ml, o una reducción de casi el 33 %.

Los parámetros c), d) y e) se utilizan para indicar al contador cómo identificar una célula viable, por ejemplo, si una célula ligeramente más oscura se contabiliza como viable, o no, etc.

La circularidad de las células, opción f), ayuda al contador a discriminar entre cualquier residuo celular presente y células viables saludables, pero esto debe usarse con precaución si las células viables del tipo de célula utilizado no son esféricas.

Por último, el valor g) permite al usuario indicar al contador si debe contar células individuales en una agrupación, o conglomerado, como parte del recuento para el total de células por ml o si la agrupación se debe contar simplemente como si fuera solo una célula.

En la Figura 5 a continuación, el contador está configurado para tratar de contar cada célula en una agrupación como célula individual. Se puede ver que, con este ajuste, el contador notifica una concentración celular viable de 10,53 x 106 células por ml.

Contador establecido para contar células individuales en las agrupaciones en la pantalla de software

Figura 5. El contador se configura para contar células individuales en agrupaciones de hasta 15 micras

Se puede ver en la agrupación de células en la parte superior izquierda de la imagen que cada célula individual se ha rodeado de un círculo verde y se añade al recuento total de células viables.

Si ajustamos el contador para contar una acumulación de células viables como si fuera solo una célula y luego se le pide al contador que vuelva a analizar el mismo conjunto de imágenes, la respuesta es muy diferente. Consulte la Figura 6 a continuación.

Contador establecido para contar las agrupaciones de células como una en la pantalla de software

Figura 6. Contador establecido para contar las agrupaciones de células como una

Obviamente depende del número de agrupaciones de células que haya en la muestra, pero en el ejemplo indicado anteriormente, el recuento de células en agrupaciones en lugar de células individuales reduce la concentración de células viables totales notificadas desde 10,53 x 106 células por ml en la figura 5 a solo 8,85 x 106 células por ml en la figura 6, una reducción de aproximadamente el 16 %. Este ajuste es aún más importante a medida que aumenta la concentración de células viables y las células se vuelven de forma natural más propensas a agruparse.

Una combinación de los ajustes del contador del a) al g) permite al usuario personalizar el modo en que el contador automatizado cuenta las células de manera que se imite con mayor precisión la forma en que el usuario cuenta con el microscopio, o de modo que se logre una coincidencia más exacta con los resultados de contabilización de un contador anterior que se sustituye con el nuevo contador automatizado.

Vea el seminario web de Tony Harrison

Tony Harrison es un gerente de producto y un especialista en cumplimiento y aplicaciones para Beckman Coulter Life Sciences. Tony ha pasado los últimos doce años en el campo de la metrología aplicada en las industrias farmacéuticas y de fabricación de productos sanitarios. Antes de eso, trabajó para empresas que proporcionaban soluciones de automatización de control de procesos para industrias manufactureras.

Tony fue editor conjunto de la Guía ISPE para la higienización por ozono de sistemas de agua farmacéutica (ISPE Guide to Ozone Sanitization of Pharmaceutical Water Systems4 y) también fue editor en jefe de la Guía de mejores prácticas de PHSS para la monitorización de salas limpias (PHSS Best Practice Guide for Cleanroom Monitoring5).

Tony es un conocido orador internacional y ha impartido seminarios educativos sobre COT, recuento de partículas líquidas, higienización de ozono para sistemas de agua y monitorización de salas limpias en el Reino Unido, Francia, Italia, India, Alemania, Malasia, China, EE. UU., Escandinavia, Irlanda, Hungría, Suiza, Indonesia, Bélgica, Grecia, Suiza, Turquía, Egipto y Dinamarca.

 

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