La centrifugación es una solución de flujo de trabajo completa para la purificación de proteínas y la cuantificación de la agregación proteica

Tipo de contenido: Libro blanco
Julia P Luciano-Chadee | Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN 46268

La agregación proteica es un fenómeno biológico causado por la interacción anormal de proteínas desestabilizadas.1La caracterización del comportamiento proteico en la solución es fundamental, ya que las proteínas desestabilizadas son susceptibles a alteraciones químicas y físicas que conducen a la pérdida de función. Lo más importante en el desarrollo de fármacos basados en proteínas es que incluso cantidades mínimas de agregados pueden causar efectos perjudiciales debidos al posible cambio en la potencia del producto biofarmacéutico y una respuesta inmunitaria adversa en los pacientes.2 Además, el número creciente de biosimilares exige estrictos procedimientos normativos que aborden adecuadamente el análisis de calidad del producto por parte de las empresas biofarmacéuticas.3

 

Muchos factores pueden influir en el comportamiento y la agregación proteicos, incluyendo la temperatura, la oxidación, la concentración, el pH, la fuerza iónica, los aditivos, los detergentes, los crioprotectores, los ciclos de congelación-descongelación y las condiciones de manipulación y almacenamiento.

La centrifugación es una potente herramienta para flujos de trabajo a fin de aíslar y caracterizar los productos proteicos.4La cartera de centrífugas de Beckman Coulter Life Sciences proporciona separaciones de calidad y análisis de proteínas de vanguardia y ofrece a los usuarios soluciones integrales de principio a fin. Una solución de flujo de trabajo basada en la centrifugación puede ser altamente eficaz porque aborda sistemáticamente la necesidad de eliminar agregados aumentado la fuerza g y los gradientes de densidad para separar partículas sobre la base de masa y densidad.

Una cadena polipeptídica no desplegada colapsa en una estructura de proteínas tridimensional plegada de manera apropiada. Por el contrario, si no se forman las interacciones clave, la proteína inestable puede agregarse y formar grumos de proteínas tóxicas
Una cadena polipeptídica no desplegada colapsa en una estructura de proteínas tridimensional plegada de manera apropiada. Por el contrario, si no se forman las interacciones clave, la proteína inestable puede agregarse y formar grumos de proteínas tóxicas
Avanti JXN 30
Centrífugas de alta velocidad Avanti

La centrifugación de mezclas de proteínas crudas es un paso requerido en el estudio de la purificación y la agregación de proteínas

Por encima del estudio de agregados proteicos está la purificación de las proteínas.5 Normalmente, las proteínas se sobreexpresan en un organismo, como bacterias, levaduras o células de mamíferos en cultivos. A fin de desarrollar estrategias únicas para aislar la proteína de interés, se utilizan las características únicas de cada proteína, como la composición de los aminoácidos, el tamaño, la forma, el punto isoeléctrico y la solubilidad. El objetivo es aislar la mayor cantidad de una proteína funcional de interés con la menor cantidad de otros contaminantes. La centrifugación es un paso importante, y a menudo el primer paso, en cualquier protocolo de purificación de proteínas. La serie AvantiJXN de centrífugas de alta velocidad dispone de una gama de rotores que facilita cualquier etapa de purificación de proteínas. La amplia selección de rotores, con diferentes combinaciones de volumen y fuerza g, convierte a la JXN en un instrumento versátil capaz de satisfacer las necesidades de una amplia variedad de proyectos de proteómica y es susceptible a diferentes tampones para promover la estabilidad de las proteínas. La purificación centrífuga de proteínas con una Avanti serie JXN de alto rendimiento es robusta y proporciona a los usuarios una técnica altamente reproducible.

Ultracentrífuga de pie Optima XPN
Ultracentrífuga Optima XPN-100
Ultracentrífuga analítica Optima AUC
Ultracentrífuga analítica Optima AUC

La ultracentrifugación es un paso poderoso para separar las proteínas de los agregados en función del tamaño

Es bien sabido que la centrifugación es un método potente y generalmente aplicable para separar una mezcla cruda de componentes celulares.4.5 Además, la ultracentrifugación combinada con gradientes de densidad es una técnica importante para separar y analizar proteínas de interés en función del tamaño y la masa.6 Durante una centrifugación bajo una fuerza gravitacional específica, las moléculas pasan de la parte superior a la parte inferior de la solución en un tubo. Este movimiento se ve compensado por la densidad y viscosidad del líquido o la fuerza de flotación. En equilibrio, el efecto neto de las fuerzas gravitacionales y de flotación provocará la acumulación de proteínas específicas en un punto específico del tubo, separando así las proteínas de los agregados con coeficientes de sedimentación diferentes.6 Las proteínas agregadas más densas se mueven hacia fuera más rápido que las moléculas de proteínas individuales más ligeras.

Los gradientes continuos de densidad por velocidad de zona se forman realizando primero una estratificación de gradiente escalonado. En la técnica más común, se pipetea una alícuota de una solución menos densa en un tubo de centrifugación y sucesivamente se introducen soluciones más densas en la parte inferior del tubo utilizando una jeringa larga de manera de no alterar la capa anterior, dejando una interfaz nítida entre las diferentes capas de densidad. Un enfoque alternativo es poner en capas soluciones cada vez menos densas de manera delicada sobre las soluciones más densas. También se puede generar un gradiente continuo a partir de un gradiente discontinuo incubando o centrifugando la solución durante un período de tiempo preestablecido o utilizando un marcador de gradientes comercial. Un tercer método, gradiente de densidad de flotación, implica una centrifugación prolongada a alta velocidad de una molécula a una densidad de solución similar, dando lugar a una separación molecular estricta.

En todas estas técnicas, la solución se difunde de tal manera que se produce un aumento gradual de la densidad desde la parte superior a la parte inferior del tubo.

Después de la formación del gradiente, se coloca un pequeño volumen de una solución que contenga la mezcla de proteínas en la parte superior del gradiente de densidad. Casi siempre, cuando el rotor centrifuga, las proteínas se mueven a través del gradiente y se separan de acuerdo con sus coeficientes de sedimentación, con los agregados proteicos sedimentando más rápido que un producto proteico de interés individual. El tiempo y la velocidad de centrifugación se determinan empíricamente.

Después de la centrifugación, las proteínas separadas se recogen normalmente perforando la parte inferior del tubo y recogiendo las fracciones gota a gota, o mediante el pipeteo manual de las fracciones desde el menisco. Se pueden realizar ensayos bioquímicos o funcionales para evaluar el contenido de proteínas de cada fracción.

Además de la separación de la agregación proteica, la purificación del complejo proteína-ligando se utiliza a menudo en el estudio de tratamientos basados en proteínas. La ultracentrífuga OptiMaxPN incluye centrífugas preparadoras compatibles con una serie de rotores y consumibles aptos para diversos protocolos en el flujo de trabajo de purificación de las proteínas.

Una técnica comúnmente utilizada en la separación de proteínas es la cromatografía de exclusión molecular (size exclusion chromatography, SEC).4En comparación con la centrifugación, la SEC requiere un gran factor de dilución, incompatibilidades de proteínas e interacciones indeseables entre proteínas y resina (efecto de matriz) y baja resolución. La centrifugación de gradiente de densidad es ventajosa porque permite a los usuarios ajustar los parámetros para separaciones eficientes regidas por las leyes de la termodinámica, modificables para todas las proteínas después de la optimización del tiempo de centrifugado, la velocidad y la condición del gradiente.7

La exposición oxidativa de proteínas en la interfaz aire-líquido también puede resultar en un aumento de la agregación.1,4,5 Para la separación de SEC son necesarias altas cantidades de agente reductor en soluciones de tampón, lo que puede añadir coste al experimento. Además, la solución de tampón típica se almacena en frascos de medios de gran volumen, con una mayor área superficial aire-líquido El sellado hermético de los tubos Opti-Seal y Quick-Seal compatibles con las ultracentrífugas Beckman Coulter minimiza la interfaz aire-líquido, lo que conduce a un producto proteico más estable y a una agregación reducida. Además, la centrifugación evita la necesidad de usar etiquetas de fusión, un perjuicio común de las técnicas de purificación de proteínas basadas en cromatografía,8 que puede afectar drásticamente a la solubilidad de la proteína.

La ultracentrifugación analítica es una herramienta poderosa para analizar las proteínas de agregados

Como se ha comentado anteriormente, la SEC como herramienta de separación tiene fallos importantes, incluyendo dilución significativa y efectos matriciales. Por lo tanto, no es ideal para la evaluación crítica del tamaño de las partículas y la agregación de productos a base de proteínas. Además, se basa en los estándares para evaluar el peso molecular, lo cual introduce una variable adicional que aumenta el margen de error y la falta de fiabilidad del método SEC.9

Por el contrario, el análisis por ultracentrifugación analítica (Analytical Ultracentrifugation, AUC) proporciona a los usuarios más respuestas que cualquier técnica similar. La AUC es la herramienta más precisa y potente10 para cuantificar la agregación proteica. Es un método absoluto que se basa en el primer principio modelo de la física para determinar la forma, el peso y la formación compleja molecular a alta resolución utilizando un intervalo de tamaños de muestra y concentraciones sin diluir. Además, la interacción superficial mínima sin estándar y sin matriz proporciona a los usuarios la posibilidad de utilizar una variedad de posibles composiciones de tampón.

En el estudio de productos y agregación proteicos, la composición del tampón (pH, fuerza iónica, aditivos, etc.) es de la mayor importancia, ya que influye directamente en la estabilidad de las proteínas.7,8,9,10 La AUC ayuda en la selección de candidatos a fármacos principales, el desarrollo de la formulación bioterapéutica, la caracterización de los productos y las evaluaciones de estabilidad.11El uso de la AUC en el análisis de calidad del producto por parte de las empresas biofarmacéuticas puede ayudar a identificar de manera eficaz la posible respuesta inmunitaria adversa de fármacos o biosimilares a base de proteínas. La nueva Optima AUC amplía el alcance de las soluciones proporcionadas por el AUC y proporciona a los usuarios parámetros de sedimentación macromolecular y caracterización de agregación bien determinados.

Referencias

  1. Philo JS, Arakawa T. Mecanismos de agregación proteica. Current Pharma Biotech 2009;10:348-51.
  2. Rosenberg AS. Effects of protein aggregates: An immunologic perspective. AAPS Journ 2006;8(3):E501-07.
  3. Niazi SK. Biosimilars and Interchangeable Biologics: Tactical Elements. Boca Ratón (FL): CRC Press; 2016.
  4. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molecular Cell Biology. Sección 3.5, Purifying, Detecting, and Characterizing Proteins. 4th ed. Nueva York (NY): W.H. Freeman; 2000.
  5. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Bioquímica. Sección 4.1, The Purification of Proteins Is an Essential First Step in Understanding Their Function. 5th ed. Nueva York (NY): W.H. Freeman; 2002.
  6. Graham JM. Biological Centrifugation. 1st ed. Oxford (Reino Unido): Bios Scientific Publishers Ltd.; 2001.
  7. Berkowitz, SA. Role of analytical ultracentrifugation in assessing the aggregation of protein biopharmaceuticals. AAPS Journ 2006;8(3):E590-E605.
  8. Louis JM, McDonald RA, Nashed NT, et al. Autoprocessing of the HIV-1 protease using purified wild-type and mutated fusion proteins expressed at high levels in Escherichia coli. Eur J Biochem 1991;199:361–69.
  9. Gabrielson JP, Arthur KK, Stoner MR, et al. Precision of protein aggregation measurements by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation in biopharmaceutical applications. Anal Biochem 2009;396:231–41.
  10. Arthur KK, Kendrick BS, Gabrielson JP. Chapter Twenty – Guidance to achieve accurate aggregate quantitation in biopharmaceuticals by SV-AUC. Methods Enzym 2015;562:477-500.
  11. Pekar A, Sukumar M. Quantitation of aggregates in therapeutic proteins using sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: practical considerations that affect precision and accuracy. Analyt Biochem 2007;367(2):225-37.

 

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