Ultracentrifugado analítico de múltiples longitudes de onda de albúmina de suero humano complejada con porfirina

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Courtney N. Johnson | UTHSCSA, Dept. of Biochemistry and Structural Biology, San Antonio, Texas
Heidi Ramsower | UTSA, Dept. of Physics and Astronomy, San Antonio, Texas
Julio Urquidi | UTSA, Dept. of Physics and Astronomy, San Antonio, Texas
Lorenzo Brancaleon | UTSA, Dept. of Physics and Astronomy, San Antonio, Texas
Borries Demeler | UTHSCSA, Dept. of Biochemistry and Structural Biology, San Antonio, Texas

Resumen

El ultracentrifugado analítico (AUC) es el método de elección para caracterizar los sistemas coloidales bajo condiciones de solución fisiológica. Recientemente, se ha desarrollado un novedoso detector por múltiples longitudes de onda (MWL) en el Optima AUC de Beckman Coulter, que por primera vez, combina la separación hidrodinámica de mezclas coloidales para la deconvolución espectral de solutos interactuantes y no interactuantes presentes en una mezcla. Aquí mostramos cómo se puede aprovechar la banda de porfirinas de Sorét complejadas con diferentes cationes para deconvolucionar espectralmente propiedades ópticas disímiles de diferentes moléculas. Se ha postulado que varios sitios en la albúmina sérica humana (HSA) poseen la capacidad de unirse directamente a los iones metálicos así como a los compuestos organometálicos. Las pruebas han generado un gran interés en el papel fisiológico de la HSA como proteína aglutinante de metales, pero también como vehículo para usos de biología sintética de las propiedades aglutinantes de los metales (por ejemplo, sangre sintética y conversión de la energía solar). Una de las interacciones más intrigantes y potencialmente útiles es la capacidad de la HSA para unirse al heme y otras metaloporfirinas. Aquí mostramos cómo el MWL-AUC en la Optima AUC puede separar de base incluso cambios diminutos en la forma hidrodinámica y el tamaño entre HSA-PPIX y apo-HSA.

Métodos

Unión y purificación de la HSA-PPIX

La albúmina de suero humano (HSA) y el dimetilsulfóxido (DMSO) se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El cloruro de estaño (Sn(IV) PPX) se adquirió en Frontier Scientific Inc. (Logan, UT). El Sn(IV)PPIX sólido se disolvió en DMSO. Luego se lo diluyó para crear un concentrado acuoso conteniendo <1 % de="" dmso.="" a="" este="" concentrado="" acuoso="" se="" le="" añadió="" la="" hsa,="" luego="" se="" dializó="" y="" posteriormente="" se="" centrifugó="" para="" crear="" una="" solución="" sin="">1/

Espectroscopía UV

Los espectros UV/visibles de la apo-HSA y HSA complejadas con porfirina se midieron en un espectrofotómetro de sobremesa. Se encuentra una absorción máxima de las porfirinas en la banda de Sorét entre 370 y 420 nm. La absorción máxima de la HSA es de ~278 nm (consulte la Figura 1).1. Se usaron los valores reales para determinar la concentración de HSA y porfirinas monomerizadas en cada muestra.

Figura 1. Espectros de absorbancia del suero humano (HSA), HSA+PPIX-Sn y HSA+PPIX-Zn   Figura 2. Gráfico de longitudes de onda medidas (círculos verdes). Se eligieron longitudes de onda que enfatizen las regiones del espectro en las que la absorbancia tiene el mayor grado de cambio.
Figura 1: Espectros de absorbancia del suero humano (HSA), HSA+PPIX-Sn y HSA+PPIX-Zn   Figura 2: Gráfico de longitudes de onda medidas (círculos verdes). Se eligieron longitudes de onda que enfatizen las regiones del espectro en las que la absorbancia tiene el mayor grado de cambio.

Ultracentrifugado analítico

Los experimentos de velocidad de sedimentación se realizaron a 45 000 rpm y 20 ºC. Las muestras se colocaron en celdas encajadas en piezas centrales de epon y ventanas de cuarzo. Se midieron muestras adicionales en tampón de NaPO4 de 10 mM. Los experimentos se realizaron con el nuevo instrumento de múltiples longitudes de onda Optima AUC de Beckman, equipado con ópticas tanto de absorbancia como de interferencia Rayleigh. Se midieron 42 longitudes de onda en modo de intensidad. Las longitudes de onda se posicionaron de forma que se garantice que las interpolaciones lineales del espectro generen la menor diferencia de RMSD entre la interpolación y el espectro medido. Este enfoque enfatiza las regiones del espectro en las que la absorbancia cambia rápidamente. Se recopilaron 45 escaneos para cada longitud de onda durante un período de 10,5 horas.

Análisis de datos del AUC-MWL

Todos los datos se analizaron con el UltraScan-III versión 2352.2 Los datos de velocidad de sedimentación se editaron definiendo el menisco, el rango de datos y la meseta para cada longitud de onda. El menisco fue equipado con análisis espectral bidimensional (2DSA)3, con sustracción simultánea del ruido con invariación temporal y radial. Al final, se realizó un paso iterativo de 2DSA. Utilizando el modelo 2DSA final para cada longitud de onda, se calculó un modelo de elementos finitos sincronizados en el tiempo para cada longitud de onda, generando una superficie de múltiples longitudes de onda (consulte las Figuras 3 y 4). La simulación resultante se descompuso en los vectores espectrales base para generar un nuevo conjunto de datos para cada componente espectralmente único (consulte la Ecuación 1).4

Ecuación 1. Cuadrados mínimos no negativos del conjunto de datos de múltiples longitudes de onda mediante la descomposición de los perfiles de las longitudes de onda en 2 vectores básicos que representan los espectros de absorbancia intrínseca de HSA y HSA-PPIX-Sn
Ecuación 1: Cuadrados mínimos no negativos del conjunto de datos de múltiples longitudes de onda mediante la descomposición de los perfiles de las longitudes de onda en 2 vectores básicos que representan los espectros de absorbancia intrínseca de HSA y HSA-PPIX-Sn

Este enfoque generará una concentración escalar para cada posición radial y tiempo de exploración para cada componente espectralmente único, lo que dará lugar a datos experimentales hidrodinámicos independientes para cada especie espectralmente única. En este caso, utilizamos los espectros de absorbancia de la apo-HSA y HSA-PPIX-Sn para separar las señales en dos conjuntos de datos hidrodinámicos espectralmente distintos. Estos conjuntos de datos se analizaron mediante análisis de Monte Carlo5 con el 2DSA o el análisis de espectro restringido paramétricamente (PCSA).6 Un gráfico de la hidrodinámica en función de la longitud de onda puede revelar las propiedades espectrales de cada especie7 como se muestra en la Figura 5.

Figura 3. 25.º exploración del modelo de elementos finitos sincronizados en el tiempo   Figura 4. 50.º exploración del modelo de elementos finitos sincronizados en el tiempo
Figura 3: 25.º exploración del modelo de elementos finitos sincronizados en el tiempo   Figura 4: 50.º exploración del modelo de elementos finitos sincronizados en el tiempo

 

Figura 5. Propiedades hidrodinámicas en función de la longitud de onda representando las propiedades espectrales
Figura 5: Propiedades hidrodinámicas en función de la longitud de onda representando las propiedades espectrales

Resultados

El objetivo de este estudio fue identificar si la HSA-PPIX purificada puede distinguirse de forma fiable de la HSA libre utilizando la AUC equipada con longitud de onda múltiple8. Para ello, mezclamos la apo-HSA con el previamente preparado complejo HSA-PPIX-Sn. Los resultados del análisis de Monte Carlo de los conjuntos de datos hidrodinámicos independientes se muestran en la Figura 6. Estos resultados muestran que separar las señales en dos conjuntos de datos hidrodinámicos distintos nos permite determinar la concentración y los parámetros hidrodinámicos de cada componente espectralmente único en la solución. Estos resultantes indican que el coeficiente de sedimentación de la HSA complejada con porfirina es levemente más alto que el de la apo-HSA.

 

Figura 6. Un experimento de longitud de onda única (278 nm) muestra dos picos, pero no es posible discernir la especie representada por esos picos.   El experimento de longitud de onda múltiple (derecha) nos permite separar de base cada componente. Esto nos permite discernir qué pico representa la apo-HSA (rojo) y cuál el complejo HSA-PPIX-Sn (azul).
Figura 6: Un experimento de longitud de onda única (278 nm) muestra dos picos, pero no es posible discernir la especie representada por esos picos. El experimento de longitud de onda múltiple (derecha) nos permite separar de base cada componente. Esto nos permite discernir qué pico representa la apo-HSA (rojo) y cuál el complejo HSA-PPIX-Sn (azul).

 

La diferencia en los espectros de absorbacia de la HSA libre y la HSA unido al PPIX se puede utilizar para separar los datos hidrodinámicos en conjuntos de datos que representen cada una de las dos especies. Como puede verse en la figura 6, la capacidad de separar espectralmente especies individuales, aunque sean hidrodinámicamente muy similares, permite separar de base mediante este método, mientras que una única longitud de onda (278 nm, que es la absorbancia pico de la apo-HSA) muestra dos picos, aunque no queda claro cuál representa la apo-HSA y cuál la especie HSA-PPIX-Sn. Esto da como resultado una resolución mucho más alta para cualquier experimento de AUC de lo que era antes posible. Además, en el caso de las mezclas conteniendo múltiples especies con diferentes espectros de absorbancia, ahora es posible derivar espectros de extinción intrínsecos para cada especie, si están bien separados hidrodinámicamente (consultar las Figuras 5 y 6). Sin embargo, en este caso, las dos especies presentes en esta mezcla hidrodinámicamente muy similares y los espectros únicos son difíciles de discernir (Figura 5). Claramente, esta mejora tiene un impacto de gran alcance en el futuro de los experimentos de la AUC, especialmente para el estudio de los sistemas de interacción en los que los socios de la interacción tienen propiedades espectrales únicas.

Referencias

  1. Hu J, Demeler B, Brancaleon L. Experimental and Computational Study of the Binding of Metalloporphyrins to the Metal Binding Sites of Human Serum Albumin (2017) Unpublished
  2. Demeler, B Methods for the Design and Analysis of Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium Experiments with Proteins. Cur. Protoc. Prot. Sci. (2010) Chapter 7:Unit 7.13.
  3. Brookes E, Cao W, Demeler B A two-dimensional spectrum analysis for sedimentation velocity experiments of mixtures with heterogeneity in molecular weight and shape. Eur Biophys J. (2010) 39(3):405-14.
  4. Gorbet GE, Pearson JZ, Demeler AK, Cölfen H, and B. Demeler. Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data Methods in Enzymology, Aug 2015. doi:10.1016/bs.mie.2015.04.013
  5. Demeler B and E. Brookes. Monte Carlo analysis of sedimentation experiments. Colloid Polym Sci (2008) 286(2) 129-137
  6. Gorbet G., T. Devlin, B. Hernandez Uribe, A. K. Demeler, Z. Lindsey, S. Ganji, S. Breton, L. Weise-Cross, E.M. Lafer, E.H. Brookes, B. Demeler. A parametrically constrained optimization method for fitting sedimentation velocity experiments. Biofímacos. J. (2014) Vol 106(8), pp1741-1750
  7. Karabudak E, Brookes E, Lesnyak V, Gaponik N, Eychmüller A, Walter J, Segets D, Peukert W, Wohlleben W, Demeler B, H Cölfen. Simultaneous Identification of Spectral Properties and Sizes of multiple Particles in Solution with sub-nm Size Resolution. Angewandte Chemie 2016 Sep 19;55(39):11770-4.
  8. Zhang J, Pearson JZ, Gorbet GE, Cölfen H, Germann MW, Brinton MA, Demeler B. Spectral and Hydrodynamic Analysis of West Nile Virus RNA-Protein Interactions by Multiwavelength Sedimentation Velocity in the Analytical Ultracentrifuge. Anal Chem. 2017 Jan 3;89(1):862-870.

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