Fundamentos de la purificación en ultracentrífuga de virus

Escuela de Postgrado de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Nagasaki
Epidemiología Molecular Profesor: Dr. Osamu Nakagomi

Dr. Osamu NakagomiEn los últimos años, la investigación de virus se ha convertido en una práctica estándar para purificar y analizar genomas e identificar virus de muestras usando kits comerciales. Dado que, para los virus establecidos sus genomas ya se conocen, la identificación del virus es posible, incluso en un estado variado. Sin embargo, para llevar a cabo una investigación detallada sobre la naturaleza de los virus, primero es necesario refinar las partículas del virus para producir un alto nivel de materiales purificados. En estos días, nuestra compañía también está recibiendo un número creciente de consultas con respecto a información sobre el uso de la ultracentrifugación para la purificación de virus. En este contexto, le preguntamos al Dr. Osamu Nakagomi, profesor de la Universidad de Nagasaki, sobre los fundamentos de la purificación de virus por ultracentrifugación, ya que es un experto en el tema. Aquí está un extracto de la entrevista con el profesor Nakagomi.e la purificación de virus por ultracentrifugación, quien es un experto en el tema. Este es el extracto de la entrevista con el profesor Nakagomi.

Por favor, cuéntenos sobre sus antecedentes en investigación.

Fig. 1. Estructura de partículas y ARN del genoma del rotavirus

Fig. 1. Estructura de partículas de rotavirus y ARN genómico

Izquierda: la partícula intacta tiene una capa externa hecha de proteínas rojas y azules y tiene una estructura de tres capas, por lo que se llama partícula de triple capa (PTC); si la capa exterior se despega, queda una partícula de doble capa (PDC) con proteínas azules. Derecha: el ARN genómico del rotavirus se separa en 11 segmentos con patrones característicos mostrados por electroforesis.

 

El diagrama de la partícula de rotavirus fue amablemente proporcionado por el profesor Prasad de la Universidad de Baylor.

Mi campo de investigación y especialidad es la epidemiología molecular del rotavirus. El Rotavirus A es uno de los virus importantes, ya que ha sido por si solo la principal causa de muerte debido a la diarrea deshidratante aguda, en bebés y niños de todo el mundo. Hasta la década de 1970, las causas de la diarrea infantil eran casi totalmente desconocidas. Con el descubrimiento del rotavirus en 1973, finalmente éste se estableció como el agente etiológico responsable de la mitad de los pacientes ingresados en las salas de pediatría con diarrea. Este fue un descubrimiento de época en la investigación de virus. Las vacunas contra el rotavirus fueron desarrolladas y autorizadas en 2006 después de superar muchos obstáculos, y la Organización Mundial de la Salud recomendó en 2009 que las vacunas contra el rotavirus se introdujeran en el programa nacional de inmunización de cada país del mundo.
Para contar brevemente sobre el virus; el rotavirus es un virus no envuelto que consiste en un genoma que comprende 11 segmentos de ARN bicatenario (Fig. 1). Al igual que otros virus de ARN, éste evoluciona rápidamente y muestra una rica diversidad genómica. No solo infecta a los humanos sino también a una variedad de otros mamíferos y aves. En la década de 1980, por primera vez, empleando una técnica epidemiológica molecular que permite el análisis a nivel de todo e genoma , pudimos establecer que el rotavirus animal puede ser patógeno y, de hecho, puede causar enfermedades en los humanos. Elucidar cómo evoluciona el rotavirus mientras usa a humanos y otros animales como huéspedes, y cómo se propaga la infección, es el núcleo de nuestro trabajo de investigación. También estamos investigando qué cambios es más probable que ocurran con el uso más extenso de vacunas. Básicamente, el análisis del genoma viral se encuentra en el corazón del estudio epidemiológico molecular d

 

Por favor, explíquenos la necesidad de la ultracentrifugación en la investigación de virus.

Cuando se extrae el genoma del virus utilizando el método clásico, las partículas del virus deben purificarse primero. Entonces se examina el genoma del virus extraído de las partículas. La ultracentrifugación tiene un papel importante en el proceso. La purificación de las partículas virales permite desde el principio garantizar que estamos tratando con el genoma del rotavirus en las partículas virales. Sin embargo, supongamos, por ejemplo, que estamos lidiando con el problema de determinar qué tipo de orgánulos de células huésped o proteínas virales y genomas se agregan en una célula infectada, la ultracentrifugación se vuelve indispensable.

Además, mientras se estudian nuevos virus, se hace cada vez más necesario investigar si el genoma está presente o no en la partícula.  En tales casos, la purificación con una ultracentrífuga se convierte en una necesidad. La información sobre la densidad de flotación, el tamaño y el coeficiente de sedimentación (valor de Svedberg, valor de S), todo lo cual se tiene en cuenta en la ultracentrifugación, es de hecho el aspecto fundamental de la virología que, en conjunto, se denominan propiedades fisicoquímicas de los virus.

Por favor, dénos bosquejos sobre la purificación de virus por ultracentrifugación.

Fig. 2. Densidades de orgánulos de virus/células y valores S 1
Figura 2: Densidades de orgánulos de virus/células y valores S 1

 

Mientras se purifica el rotavirus en muestras obtenidas de pacientes, debemos separar los orgánulos celulares, las macromoléculas biológicas y similares del virus. Esto se puede lograr ya que estas partículas tienen una variedad de tamaños y densidades. La purificación de virus por ultracentrifugación utiliza espacios de densidad en los que otras partículas no descansan mediante el uso de una combinación de "centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, que se ve afectada por el valor S de las partículas" y "centrifugación en equilibrio de gradiente de densidad de cloruro de cesio (ultracentrifugación de equilibrio de densidad), que se ve afectada por la densidad flotante de partículas en un solvente ”. La Fig. 2 muestra la relación entre la densidad de bandas (la densidad a la que aparecen las bandas durante la centrifugación en gradiente de densidad) y el valor S. El virus se encuentra exactamente en espacios entre una variedad de partículas celulares, incluidos los microsomas y los ribosomas. Los virus son complejos de proteínas (principalmente con una densidad flotante de 1,3 g/cm³) y ácidos nucleicos (principalmente con una densidad flotante de 1,7 g/cm³), por lo que la densidad flotante oscila entre 1,35-1,4 g/cm³. Por otro lado, el tamaño de los virus alcanza valores de S de 100-1.000. Los valores S de las fracciones microsómicas se superponen con los de los virus (eje horizontal), pero es posible la separación por densidad (eje vertical). Por lo tanto, la separación se realiza usando centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, cloruro de cesio y similares. Las fracciones de virus tienen una densidad mayor que las fracciones microsómicas porque incluyen ácidos nucleicos. Además, cuanto mayor es el virus, mayor es su valor S. La ultracentrifugación implica la purificación mediante la combinación de estos dos parámetros, por lo que es evidente que está estrechamente vinculada a las propiedades fisicoquímicas.

La centrífuga también es extremadamente importante para discernir estas propiedades fisicoquímicas. El tamaño también se puede determinar de manera confiable con un microscopio electrónico, pero si hay una nueva cepa de virus, el discernimiento de saber dónde descansará el virus cuando se centrifugue es importante. Por ejemplo, el virus de la influenza y el rotavirus con un tamaño moderado de 100 nm, se hundirían si se hacen girar durante toda la noche a más de 10,000 rotaciones usando una centrífuga refrigerada de alta velocidad Avanti. Sin embargo, los norovirus que miden 30 nm de tamaño no se hundirían con la centrífuga Avanti y, en tales casos, sería necesaria una ultracentrífuga Optima. Para hacer que las partículas de 30 nm se hundan con una centrífuga Avanti, se realiza una purificación después de reducir el volumen siguiendo procedimientos como la salinización. Además, cuando se trata de volúmenes de procesamiento, los siguientes métodos se consideran del orden de mayor a menor: método de centrifugación diferencial (granulación normal), método de amortiguación y método de gradiente de densidad. El método de amortiguación permite que el 60-70% del tubo se llene con la muestra, pero el volumen se reduce al 10-15% en la centrifugación de gradiente de densidad. Por lo tanto, después de determinar las características de comportamiento de las partículas utilizando el método de gradiente de densidad, el método de amortiguación se utiliza para permitir que se procese un mayor volumen de muestras. Por ejemplo, la partícula de rotavirus pasa a través de una capa de sacarosa al 30%, pero no pasa a través de una capa de sacarosa al 70%, por lo que el virus puede concentrarse en la interfaz entre las capas de sacarosa al 30% y 70% (Fig. 3). 

Por favor, cuéntenos acerca de la purificación por ultracentrifugación de un virus específico.

Rotores de ángulo fijo versus ángulo basculante

En general, si se comparan rotores que producen la misma fuerza centrífuga, el rotor de ángulo fijo permite procesar un mayor volumen y es más fácil de usar. Sin embargo, debido a que los rotores oscilantes de mayor carga, como el SW 32 Ti, permiten cargar los cucharones desde la parte superior, se puede eliminar la diferencia en la facilidad de uso. De hecho, como los rotores de ángulo basculante requieren una tapa en el tubo, se podría argumentar que son mucho más fáciles de manejar.

Si desea eliminar con cuidado las bandas producidas por centrifugación de gradiente de densidad, se recomienda el uso preferente de rotores de ángulo basculante. Con rotores de ángulo fijo, los pellets dejan rastros en la superficie de la pared, lo que problemático. En particular, recientemente, la sensibilidad de detección de RT-PCR ha aumentado, lo que hace necesario considerar niveles de contaminación que podrían haberse ignorado previamente.

En general, creo que los rotores de ángulo fijo deberían seleccionarse si se requieren volúmenes mayores, y los rotores oscilantes deberían usarse si la contaminación es una preocupación.

 

Preparación de la muestra

Explicaré el paso de preparación de la muestra usando la purificación del rotavirus a partir del fluido de cultivo infeccioso (ICF) como ejemplo. Dado que el rendimiento de las partículas de virus purificadas es aproximadamente proporcional al volumen inicial, es preferible usar 1 L de ICF. algunos pueden considerar;

Una vez que se ha logrado un cierto grado de concentración utilizando una centrífuga refrigerada de alta velocidad, se concentra y purifica aún más, utilizando una ultracentrífuga de piso y un rotor basculante SW 32 Ti o SW 55 Ti. En mi opinión, el SW 32 Ti es un "rotor de ensueño" porque su diseño lo hace fácil de usar. Utilizamos este rotor en la ultracentrífuga Optima de Beckman Coulter Life Sciences que tenemos en nuestro laboratorio. Considero que la últracentrifuga Optima es un asociado confiable, especialmente cada vez que centrifuga durante la noche. Sé que siempre puedo contar con ella y confiar en que él al día siguiente obtendré los resultados esperados. Y nunca me ha decepcionado.

Fig. 3 Nuestro protocolo para purificar rotavirus a partir de ICF.
Al principio, para eliminar los desechos celulares, se divide 1 litro de ICF en 6 botellas que se centrifugan durante 10 minutos a 15.000 xg utilizando un rotor de ángulo fijo JA-14. Este paso se puede omitir, pero si se hace así, en el siguientAdemás, si hay una gran cantidad de impurezas, el virus se enreda en ellas, lo que podría disminuir el rendimiento.
Después de eliminar los restos celulares, el sobrenadante restante se somete a una centrifugación adicional durante 14-16 horas a 30.000 xg usando un rotor de ángulo fijo JA-14 para obtener los gránulos donde están los virus. Si tiene prisa, puede usar una ultracentrífuga y procesar 300 mL a la vez con un rotor de ángulo fijo Tipo 45 Ti. Puede centrifugar rápidamente estas muestras a 30.000 rpm por 2 horas o 40.000 rpm por 1.5 horas. A continuación, suspenda los gránulos en 26 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Decidir en qué volumen de PBS se suspenderán los gránulos requiere experiencia e intuición. En general, nunca concentre a más de 1 a 10 en cada paso de purificación. Por ejemplo, si su material de partida es de 1 L, no debe concentrarse por debajo de 100 mL; si se concentra para decir, 10 mL, el producto resultante estará turbio. Para facilitar el manejo, puede optar por concentraciones más altas, pero se arrepentirá más tarde. Sin embargo, esto es solo una regla general.e paso habrá más impurezas durante la ultracentrifugación con el método de amortiguación. Cuanto más tratamiento previo, más fáciles y limpias serán las operaciones posteriores.  

Además, si hay una gran cantidad de impurezas, el virus se enreda en ellas, lo que podría disminuir el rendimiento.
Después de eliminar los restos celulares, el sobrenadante restante se somete a una centrifugación adicional durante 14-16 horas a 30.000 xg usando un rotor de ángulo fijo JA-14 para obtener los gránulos donde están los virus. Si tiene prisa, puede usar una ultracentrífuga y procesar 300 mL a la vez con un rotor de ángulo fijo Tipo 45 Ti. Puede centrifugar rápidamente estas muestras a 30.000 rpm por 2 horas o 40.000 rpm por 1.5 horas. A continuación, suspenda los gránulos en 26 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Decidir en qué volumen de PBS se suspenderán los gránulos requiere experiencia e intuición. En general, nunca concentre a más de 1 a 10 en cada paso de purificación. Por ejemplo, si su material de partida es de 1 L, no debe concentrarse por debajo de 100 mL; si se concentra para decir, 10 mL, el producto resultante estará turbio. Para facilitar el manejo, puede optar por concentraciones más altas, pero se arrepentirá más tarde. Sin embargo, esto es solo una regla general.

 

Fig. 3. Purificación de rotavirus
Fig. 3Purificación de rotavirus

Purificación por Ultracentrifugación

Las impurezas se pueden eliminar aún más utilizando el método de amortiguación de sacarosa con un rotor oscilante SW 32 Ti de gran capacidad. Las partículas de rotavirus pueden concentrarse en la interfaz entre las capas de sacarosa al 30% (p/v) y al 70% (p/v). Para esto, dispense 4,5 mL de solución de sacarosa al 70% en la base de un tubo de ultracentrífuga de 38,5 mL y coloque 6,5 mL de solución de sacarosa al 30% encima, que luego se cubre con 26 mL de la suspensión del virus en PBS. Cuando finaliza la ultracentrifugación en las condiciones indicadas en la Fig. 3, las impurezas se acumularán en grandes cantidades por encima de la capa de solución de sacarosa al 30% y las partículas de rotavirus se agruparán entre el cojín de sacarosa al 70% y al 30% y aparecerán como una banda blanca. La banda blanca se puede recoger de tres formas diferentes; insertando directamente una jeringa en la banda para extraer la banda blanca; recoger la banda blanca después de eliminar las capas de líquido innecesarias justo encima de ella, o separando las fracciones insertando una aguja a través de la base del tubo. 

Sin embargo, naturalmente se puede formar un gradiente de densidad después de la ultracentrifugación incluso con solo dos capas. Este es un pequeño truco. Coloque una capa de 0.5-0.8 mL de fracción de virus cruda obtenida por el método de amortiguación (siempre es mejor usar una pequeña cantidad de la solución en este caso) encima de una solución de cloruro de cesio y realizar ultracentrifugación durante 16-20 horas a 257.000 xg. Dieciséis horas significan comenzar la centrifugación en la anochecer del día anterior y recoger a la mañana siguiente, pero no es necesario ser estricto sobre la duración. 

Como puede ver en la Fig. 3, hay dos bandas visibles de rotavirus en el tubo. La banda superior comprende 1,36 g/cm³ de partículas de triple capa de rotavirus intactas (TLP) y la banda inferior comprende 1.38 g/cm³ de partículas de doble capa (DLP) en las que se despoja la cubierta externa. Las partículas de virus contienen ARN. El DLP tiene menos proteínas que el TLP; por lo tanto, la proporción de ácidos nucleicos es mayor, por lo que es más pesada. La banda azul de arriba es de las partículas vacías que consisten solo en proteínas sin ácidos nucleicos y debido a que son proteínas, la densidad de flotación es de alrededor de 1,3 g/cm³. De hecho, cuando se retira la cubierta externa del TLP para revelar el DLP, se activa la ARN  Para aumentar aún más el grado de pureza, la centrifugación de gradiente de densidad se puede realizar utilizando un rotor de ángulo basculante SW 55 Ti de baja capacidad. Para esto, dispense una solución de cloruro de cesio al 55% (p/v) en la base de un tubo de ultracentrífuga de 5 mL y luego cubre con la misma cantidad de solución de cloruro de cesio al 40% (p/v). Las graduaciones de densidad se producen colocando capas de soluciones con diferentes densidades, y este procedimiento a menudo se considera lento. polimerasa. Y en los experimentos que involucran ARN polimerasa, se usa el rotavirus DLP con la cubierta externa eliminada.

Limpieza del rotor

Dado que se usa cloruro de cesio de alta densidad, es importante lavar el rotor a fondo con agua tibia después del uso para evitar la corrosión. 

El personal del laboratorio de epidemiología molecular
El personal del Laboratorio de Epidemiología Molecular

1. Mazzone HM. CRC Handbook of Viruses: Mass-Molecular Weight Value and Related Properties. Boca Raton (FL): CRC Press LLC; 1998.