Aplicaciones de ultracentrifugación en la purificación y caracterización de biomoléculas

Tipo de contenido: Póster
Akash Bhattacharya,1 Ross VerHeul,2 Eric Von Seggern,1 Stephen Otts,2 Beckman Coulter, Inc., 1Loveland, CO y 2 Indianapolis, IN, EE. UU.

Introducción

Las ultracentrífugas procesan muestras con fuerzas centrífugas que normalmente van de 100 000 a 1 000 000 x g. A estas altas fuerzas, las moléculas constituyentes de la muestra se separan en función de sus propiedades físicas (p. ej., tamaño, masa, densidad o anisotropía). En consecuencia, la ultracentrifugación se suele usar para purificar y caracterizar polímeros de bajo peso molecular hasta complejos de proteínas de multimegaDalton y orgánulos.

Ultracentrifugación de preparación

Ultracentrifugación de preparación 

Ultracentrifugación diferencial

  1. Las partículas se separan en función de su tamaño y masa (coeficiente de sedimentación, S).
  2. Se pueden utilizar múltiples pasos de precipitación para el enriquecimiento iterativo.
  3. Ideal para separar grupos de partículas de muy diferentes tamaños.

 

Ultracentrifugación de gradiente de densidad (DGUC) 

Ultracentrifugación de gradiente de densidad (DGUC)

  1. Las partículas solubles se separan en una columna de líquido de densidad variable (gradiente de densidad).
  2. En los experimentos zonales de velocidad, las partículas migran a diferentes velocidades, dictadas por sus valores S, y dependen del tiempo.
  3. Las separaciones isopícnicas son insensibles al tiempo, donde las partículas migran a su densidad de flotación aparente en el gradiente.
  4. Ideal para la separación de alta resolución de materiales pequeños con propiedades físicas similares.

 

Ejemplo de flujo de trabajo para la purificación por DGUC de ADN plasmídico

  1. El ADN plasmídico se puede extraer de bacterias utilizando diversos métodos.
  2. El flujo de trabajo que aparece a continuación muestra una extracción y purificación de lisis alcalina común mediante un método de gradiente de densidad de cloruro de cesio (CScl) con bromuro de etidio.
  3. También pueden usarse materiales de gradiente de densidad más reciente (p. ej., iodixanol/OptiPrep) y sondas de interacción de ADN (p. ej., DAPI y GelGreen) en purificación de plásmidos.

 

Ejemplo de flujo de trabajo para la purificación por DGUC de ADN plasmídico 

 

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