El aislamiento eficiente de ácidos nucleicos sin kit utiliza una combinación de métodos de separación mediante precipitación y centrifugación

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Julia P Luciano-Chadee, Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN 46268

Descripción general

La inmunoterapia y el tratamiento génico requieren ADN altamente purificado para proporcionar un mensaje de edición génica, o plásmido, a la célula anfitriona. La minipreparación de plásmido sin kit se ha utilizado tradicionalmente para ofrecer ADN de alta calidad y de alto rendimiento. Este método se realiza mediante una combinación de sales e isopropanol y la precipitación eficaz de ácidos nucleicos de soluciones mediante centrifugación. Es de rendimiento elevado, rentable y produce mayores producciones, ya que no hay pérdida de material debido a la interacción con la membrana o el filtro.

Introducción

La inmunoterapia es una técnica terapéutica que reacondiciona el sistema inmunitario para combatir enfermedades. Requiere reprogramar o reentrenar las células mediante el tratamiento con material genético directo o un producto biológico como un sistema de administración génica a través de virus.

El material inicial, casi siempre, se deriva de la producción y aislamiento de un plásmido que contiene la pieza reprogramadora de ADN. El aislamiento del ADN plasmídico es un paso crucial para producir material de alta calidad para las transferencias génicas de inmunoterapia. Además de la inmunoterapia, muchas técnicas de biología molecular requieren ADN plasmídico altamente purificado y concentrado.

Los adenovirus están a la vanguardia de los sistemas de administración genética en inmunoterapia. La inmunoterapia basada en adenovirus ha sido evaluada y optimizada para aumentar la seguridad y mejorar su eficacia. En resumen, comienza con la generación del vector de expresión de los baculovirus recombinantes, bacmid, de las células bacterianas anfitrionas.

Aquí describimos el aislamiento de plásmidos de bacmid utilizando una combinación tradicional de sales e isopropanol y la separación eficiente de los ácidos nucleicos de las soluciones mediante centrifugación (figura 1).

Figura 1: Descripción esquemática de una precipitación de isopropanol de ácidos nucleicos
Figura 1. Descripción esquemática de una precipitación de isopropanol de ácidos nucleicos.

 

Lo que se necesita

  1. Cepa bacteriana de máxima eficiencia DH10Bac (cat. 10361-012), pFastBac-gus (cat. 91401), espectofotómetro NanoDrop 8000 equipado con software de medición versión 2.3.2, todo comprado a Thermo Scientific.
  2. El modelo IVD Microfuge 20R (ref. B30147) equipado con rotor FA241.5P proviene de Beckman Coulter Inc.

Lo que se tiene que hacer

Transformación de choque térmico

100 μl de bacterias fueron repartieron alícuotamente en un tubo de 15 ml con fondo redondo preenfriado. Se añadió 1 ng de plásmido FastBac al tubo de bacterias. Las células y la mezcla de plásmidos se incubaron en hielo durante 30 minutos. A continuación, el tubo se colocó a 42 °C durante 45 segundos e inmediatamente se transfirió a un baño de agua de hielo durante 2 minutos. Se añadieron 500 μl de medio SOC al tubo y se permitió que las células se recuperaran durante 4 horas a 37 °C mientras se agitaban a 220 rpm. Las células se colocaron en la placa de agar LB condicionada, en la que se utilizaron kanamicina (kan), gentamicina (gen), tetraciclina (tet) e IPTG para su selección. Se observaron colonias positivas después de 48 horas.

Crecimiento y cultivo celular

Se recogió una colonia positiva única y se resuspendió en 5 ml de LB complementada con kan/gen/tet/IPTG y se la permitió crecer a 37 °C mientras se agitaba a 220 rpm. Después de 16 horas, las células se centrifugaron en la Microfuge 20R equipada con rotor FA241.5P a 10.000 x g de RCF durante 2 minutos. El sobrenadante se desechó y el sedimento se mantuvo para el siguiente paso.

Aislamiento de plásmidos

El aislamiento de plásmidos consta de cinco pasos: lisis celular, eliminación de residuos, precipitación de ácidos nucleicos, aislamiento de ácidos nucleicos y resuspensión. Todas las soluciones se prepararon con antelación y se almacenaron a la temperatura de trabajo correspondiente. La Microfuge 20R equipada con rotor FA241.5P se utilizó en todos los pasos de centrifugación.

Figura 2: Espectros de ácido nucleico del plásmido de bacmid.
Figura 2. Espectros de ácido nucleico del plásmido de bacmid.
  1. Lisis celular. En primer lugar, las células se introdujeron en una solución con 500 μl con 25 mm de Tris-HCl (Ph 8), 50 mm de glucosa, un tampón de EDTA de 10 mm suplementado con 1 % de RNAsa A. El tubo se inviertió cinco veces siguindo con una adición de 500 μl de tampón de lisis alcalina que contenía 0,2 N NAcl y SDS 1 % (p/v). El NaOH es importante para romper las paredes celulares, pero lo más importante es que desnaturaliza el ADN, un paso importante en la separación. El SDS desnaturaliza las proteínas celulares. El tubo se invertió cinco veces y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron 500 μl de solución de acetato potásico 5M a la mezcla para la renaturalización y estabilización del ADN plasmídico. Se trata de un paso selectivo que separa solo el ADN plásmido pequeño del ADN genómico de las células anfitrionas. La mezcla se incuba en hielo durante 10 minutos
  2. Limpieza de residuos. Para separar el plásmido deseado de los contaminantes como el ADN del anfitrión, las proteínas y los residuos celulares, la muestra se centrifuga a 15.000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. La solución de ácido nucleico se transferió a un tubo nuevo.
  3. Precipitados de ácidos nucleicos. Para separar el ácido nucleico de la solución, se añadió 800 μl de isopropanol a la mezcla. El tubo se incubó en hielo durante 10 minutos. Este paso precipitó el ADN en el sedimento.
  4. Aislamiento de ácidos nucleicos. El ADN plasmídico deseado debe separarse de las impurezas mediante centrifugación. La muestra se centrifugó a 15.000 x g de RCF a temperatura ambiente durante 15 minutos. El sedimento de ADN se enjuagó en 500 μl de etanol muy frío y se secó al aire durante 10 minutos.
  5. Resuspensión. El sedimento de ADN seco se resuspendió en agua o un tampón de 70 μLTE y se analizó para determinar la concentración (y la calidad)

 

Lo que se puede esperar

Se utilizó un espectofotómetro equipado con un software de medición. 2 μl de muestra se midió en el espectrofotómetro NanoDrop 8000. 5 ml de rendimiento bacteriano 332,1 ng/μl†. Los espectros (Figura 2) muestran un patrón típico para ácidos nucleicos, con una relación 260/280 de 2,1 y una relación 260/230 de 1,8.

Conclusión

El aislamiento de plásmidos tradicionales es eficiente y económico. Aparte de la preparación del tampón utilizando productos químicos de laboratorio estándar, el método de aislamiento de ADN basado en precipitación solo necesita una centrífuga. Los resultados obtenidos de la purificación de ADN sin membrana y sin filtro (figura 2) proporcionan el flujo de trabajo con una concentración plasmídica adecuada para producir partículas víricas de adenovirus recombinantes de alta calidad. El cultivo inicial también puede optimizarse para escalar hasta 500 μg de plásmido, si lo desea, sin necesidad de añadir un coste significativo al comprar kits comerciales. Además, las técnicas de centrifugación alternativas también pueden proporcionar una solución para aislar ADN a gran escala. La ultracentrifugación de ADN en gradientes CsCl produce grandes cantidades de ADN sumamente purificado para fines de inmunoterapia o cualquier aplicación posterior.

Referencias

Moore, D. y Dowhan, D. 2002. Purificación y concentración de ADN de soluciones acuosas. Protocolos actuales en biología molecular. 59:I:2.1A:2.1.1–2.1.10.
Maniatis, T, E F Fritsch y J Sambrook. Clonación molecular: Un manual de laboratorio. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982
Smith, A D, ed. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. 2.ª edición. Oxford: Oxford University Press, 2000.

† Los resultados generados a partir de los softwares enumerados en esta sección no están garantizados. Consulte las herramientas de software específicas para ver los avisos legales individuales.

CENT-4959PST02.19