Descifrando la enfermedad mediante biomarcadores exosomales

Los exosomas son pequeñas vesículas (<150 nm) circulantes rodeadas de membrana que se producen por endocitosis en la membrana celular y se liberan por exocitosis tras la fusión con la membrana de los cuerpos plurivesiculares1.  A pesar de su tamaño diminuto, los exosomas contienen mucha información sobre la salud de sus células y órganos de origen, lo que hace que sean perfectamente adecuados para aplicaciones diagnósticas como biomarcadores de enfermedad.  Al formarse, los exosomas encapsulan una pequeña muestra de componentes celulares, como membrana citoplasmática (incluidas proteínas de superficie), citosol, ADN, ARN (incluidos ARNm y microARN) y proteínas. Aislar los exosomas y analizar sus partes constituyentes puede revelar modificaciones frecuentes en estados patológicos, lo que permite una detección temprana y un diagnóstico menos invasivo.  

Los métodos mínimamente invasivos para la caracterización y el diagnóstico de enfermedades ya son frecuentes para muchas enfermedades en que el acceso a las muestras no está limitado, como los cánceres sanguíneos y los trastornos cutáneos, pero los biomarcadores exosomales son una herramienta fundamental para desarrollar métodos mínimamente invasivos para estudiar la historia natural de las enfermedades que atacan a compartimentos más resguardados y difíciles de muestrear, como el cerebro y la médula espinal2-5, los riñones6-8, el corazón y los vasos9, 10.  

Fuente de exosomas

Los exosomas se pueden aislar prácticamente en cualquier fluido corporal, pero para un diagnóstico o pronóstico de óptimo valor es mejor escoger un fluido en contacto directo con el(los) órgano(s) de interés. Para un análisis de estado patológico en todo el organismo, la sangre es una primera opción razonable, ya que es el fluido que está en contacto con todos los órganos.  Otros fluidos biológicos que se han examinado para contenido exosomal con buenos resultados son líquido amniótico11, leche materna12, saliva11, lágrimas13 y orina14, 15. Estas muestras llamadas biopsias líquidas, un término que se usó por primera vez en la literatura científica en 1974(16), permiten la vigilancia no invasiva de la función de los órganos a través de los fluidos que los rodean, incluido su contenido exosomal.

La pureza de las preparaciones de exosomas es de importancia primordial para tener análisis fiables y repetibles, por lo que se debe prestar especial atención al mantenimiento de la pureza de los fluidos que contienen exosomas. Cuando obtenga su muestra de fluido, tenga precaución de evitar la contaminación accidental de su compartimento de fluido puro con otros fluidos biológicos. Esta forma de contaminación es menos preocupante cuando se extrae sangre, si la sangre es el fluido deseado, pero cuando se extrae fluido de otros compartimentos, como el espacio subaracnoideo de la columna vertebral o la junta sinovial de la rodilla, se deben tomar precauciones especiales para evitar contaminar la muestra con sangre de la cánula de la aguja.  Incluso cuando el fluido se recoge de forma no invasiva, por ejemplo mediante una recolección limpia de orina expulsada, se deben seguir las buenas prácticas para evitar la contaminación de la muestra.  

Aislamiento de exosomas

Actualmente existen varios métodos utilizados frecuentemente para aislar exosomas de las biopsias líquidas, incluidos ultracentrifugado diferencial, centrifugado de gradiente de densidad, microfiltración, esferas magnéticas revestidas de anticuerpos y dispositivos microfluídicos; siendo el ultracentrifugado diferencial el método considerado de referencia para el aislamiento de exosomas.17 Dado que el ultracentrifugado diferencial es el método más utilizado para el aislamiento de exosomas, debe señalarse la importancia de emplear el protocolo correcto con el rotor correcto para garantizar la reproducibilidad y la fiabilidad de los resultados.18 

Comparación de los métodos de aislamiento de exosomas

Ultracentrifugado diferencial

  • Ventajas: Método de referencia, se adapta fácilmente para tener en cuenta la viscosidad de la muestra
  • Desventajas: Largo período de rotación, no se pueden separar los virus de los exosomas, coprecipitación de proteínas

Centrifugación de gradiente de densidad

  • Ventajas: Menos coprecipitación no deseada, métodos especializados permiten la separación de los virus
  • Desventajas: Precipitación no específica de especies del mismo tamaño

Microfiltración

  • Ventajas: Mayor rapidez
  • Desventajas: Interacción matriz/membrana, copurificación de proteínas, recuperación subóptima

Esferas magnéticas revestidas de anticuerpos

  • Ventajas: Aislamiento muy específico de una población de exosomas
  • Desventajas: No adecuado para muestras de gran volumen, los exosomas pueden no eluir intactos de las esferas

Dispositivos microfluídicos

  • Ventajas: Menor coste, se requiere menos cantidad de muestra
  • Desventajas: Eficacia variable según los distintos protocolos

 

Cualquiera que sea el método de aislamiento que elija, hay un arte en la ciencia del aislamiento de exosomas por el cual más no siempre es mejor. La mejor guía es el buen juicio y la experiencia previa. La utilización estricta de cortes por tamaño o de requisitos de antigenicidad muy exigentes puede ser tan perjudicial como una interpretación laxa de los mismos. La idea clave a tener en cuenta es que la pureza y la integridad de las muestras son la máxima prioridad.  Mantener una muestra de exosomas pura requiere una vigilancia en todas las etapas del procedimiento de aislamiento de exosomas para evitar pérdidas en la muestra y mantener la fiabilidad de los datos.

Tal como sucede con cualquier estructura rodeada de membrana, ya sea un exosoma o una célula animal, la manipulación brusca o inadecuada puede provocar la lisis del conjunto. La lisis accidental de exosomas antes de tener la muestra a punto es la principal manera en que se pierden las muestras. Para evitarlo, debe prestarse atención a ejecutar cada paso del protocolo a la temperatura recomendada y con el tampón recomendado, al mismo que tiempo que se mantiene la muestra alejada de detergentes y metaloproteasas de matriz.

La manipulación inadecuada de las muestras, sobre todo durante los lavados, puede provocar la pérdida de la muestra completa.  Deben marcarse siempre los tubos para reconocer la etapa concreta del protocolo: esto puede contribuir a evitar que se vierta un sobrenadante con valiosos exosomas o que se descarte un tubo que contenga un sedimento aprovechable.  Este es el error más común que se comete en cualquier protocolo con etapas variables que incluyan lavados y sobrenadantes. Estar prevenido es estar preparado y también lo es ser mesurado, atento y metódico.  

Caracterización de enfermedades mediante exosomas

Para diagnosticar o seguir la evolución de una enfermedad utilizando biomarcadores exosomales, primero hay que establecer un valor inicial de un perfil exosomal saludable o no patológico.  Esto puede implicar un estudio de poblaciones para evaluar la gama de posibles variaciones en el perfil saludable, un estudio longitudinal del perfil exosomal de un solo paciente, antes y después de la aparición de la enfermedad (lo cual requiere o bien una paciencia extrema o una coincidencia fortuita) o -y esta opción interesará a aquellos que no tengan acceso a un suministro ilimitado de pacientes no contrarios a las agujas- una comparación entre exosomas producidos por una línea celular “normal” y una línea celular “patológica”.  

Uno de los cargamentos exosomales que con mayor frecuencia se usa en el diagnóstico y el pronóstico de enfermedades son los microARN (miARN), ya que su presencia o ausencia se puede emplear como biomarcador para predecir directamente el riesgo19, la aparición20, la evolución21 o la remisión22 de la enfermedad.  El aislamiento de miARN de fracciones exosomales se ha estandarizado23 y ahora es un método frecuentemente utilizado para enriquecer en miARN específicos de enfermedad procedentes de todo el organismo o de un órgano en concreto.  

El descifrado de la enfermedad mediante biomarcadores exosomales, ya sea en una línea celular o en una población humana, es una técnica robusta que está arrojando luz sobre el mayor valor predictivo de estos mensajeros circulantes, mensajeros que, en la historia reciente, se consideraban tan solo paquetes de desechos a eliminar.  Está claro que todavía hay mucho que aprender sobre estos diminutos mensajeros.  

Referencias:
1. Théry C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Cur. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3: Unit 3.22.
2. Gui Y, Liu H, Lv W, Hu X. Altered microRNA profiles in cerebrospinal fluid exosome in Parkinson disease and Alzheimer disease. Oncotarget 2015;6:37043-37053.
3. Fiandaca MS, Kapogiannis D, Mapstone M, et al. Identification of preclinical Alzheimer’s disease by a profile of pathogenic proteins in neutrally derived blood exosomes: A case-control study. Alzheimers Dement 2015;11:600-607.
4. Jagot F, Davoust N. Is it worth Considering Circulating microRNAs in Multiple Sclerosis? Front Immunol 2016;7:129. doi: 10.3389/fimmu.2016.00129.
5. Zhang ZG, Chopp M. Exosomes in stroke pathogenesis and therapy. J Clin Invest 2016;126:1190-1197. doi: 10.1172/JCI81133.
6. Bruno S, Porta S, Bussolati B. Extracellular vesicles in renal tissue damage and regeneration. Eur J Pharmacol 2016;pii:S0014-2999(16)30427-7. doi: 10.1016/j.ejphar.2016.06.058. 
7. Santucci L, Bruschi M, Candiano G, et al. Urine Proteome Biomarkers in Kidney Diseases. I. Limits, Perspectives, and First Focus on Normal Urine. Biomark Insights 2016;11:41-48. doi:10.4137/BMI.S26229.
8. Junker K, Heinzelmann J, Beckham C, et al. Extracellular Vesicles and Their Role in Urologic Malignancies. Eur Urol 2016;70:323-331. doi: 10.1016/j.eururo.2016.02.046.
9. Cheow ES, Cheng WC, Lee CN, et al. Plasma-derived extracellular vesicles contain predictive biomarkers and potential therapeutic targets for myocardial ischemic injury. Mol Cell Proteomics 2016; pii:mcp.M115.055731. [Epub antes de imprenta]
10. Kishore R, Garikipati VN, Gumpert A.Tiny Shuttles for Information Transfer: Exosomes in Cardiac Health and Disease. JCardiovasc Transl Res 2016;9:169-175.doi:10.1007 / s12265-016-9682-4.
11. Keller S, Ridinger J, Rupp AK, et al. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J Transl Med 2011;9:86.
12. Admyre C, Johansson SM, Rahman Qazi K, et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol 2007;179:1969-1978. doi: 10.4049/jimmunol.179.3.1969.
13. Grigor’eva AE, Tamkovich SN, Eremina AV, et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochem 2016;10:165-172.
14. Wiggins R, Glatfelter A, Kshirsagar B, Beals T. Lipid microvesicles and their association with procoagulant activity in urine and glomeruli of rabbits with nephrotoxic nephritis. Lab Invest 1987;56:264-272.
15. Harpole M, Davis J, Espina V. Current state of the art for enhancing urine biomarker discovery. Expert Rev Proteomics 2016;13:609-626.
16. Sorrells RB. Synovioanalysis (“liquid biopsy”). J Ark Med Soc 1974;71:59-62.
17.  Momen-Heravi F, Balaj L, Alian S, et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol Chem 2013;394:1253-1262. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.
18. Livshits MA, Khomyakova E, Evtushenko EG, et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep 2015;5:17319. doi:10.1038/srep17319.
19. Ghanbari M, Ikram MA, de Looper HW, et al. Genome-wide identification of microRNA-related variants associated with risk of Alzheimer’s disease. Sci Rep 2016;6:28387. doi: 10.1038/srep28387.
20. Zhang T, Shang Q, Lv C, et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun 2015;463:60-63. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.05.017.
21. Farr RJ, Joglekar MK, Hardikar AA Circulating microRNAs in Diabetes Progression: Discovery, Validation and Research Translation. EXS 2015;106:215-244. doi: 10.1007/978-3-0348-0955-9_10.
22. Freres P, Wenric S, Boukerroucha M, et al. Circulating microRNA-based screening tool for breast cancer. Oncotarget 2016;7:5416-5428. doi:  10.18632/oncotarget.6786.
23. Lasser C. Identification and Analysis of Circulating Exosomal microRNA in Human Body Fluids. Methods in Molec Biol 2013;1024:109-128. doi: 10.1007/978-1-62703-453-1_9.



Contact Us


















Manténganme informado sobre seminarios web, productos, artículos y servicios de Beckman Coulter, incluidos los productos, artículos o servicios de nuestras empresas afiliadas.



Al enviar este formulario, confirmo que he revisado y acepto la Política de privacidad y los Términos de uso. Asimismo, comprendo mis opciones de privacidad ya que pertenecen a mis datos personales, según lo previsto en la Política de privacidad, sección “Sus opciones de privacidad”.