Los exosomas llevan los modelos de enfermedades al siguiente nivel: De la jaula a la placa

Históricamente el método más frecuente para estudiar un proceso patológico ha consistido en elaborar un modelo animal y analizar la histología y la bioquímica de los tejidos en busca de alteraciones en la expresión de proteínas, pero un pequeño avance en biología celular está destinado a causar un gran impacto en la forma en que pensamos sobre las enfermedades y en como las estudiamos.  Los exosomas son pequeñas vesículas (<120 nm) rodeadas de membrana que las células liberan al fluido intersticial que baña las células.  A causa de la manera en que se forman -se desprenden de los endosomas y se fusionan con la membrana citoplasmática- los exosomas contienen una muestra de los ADN, los ARN y las proteínas que se encuentran en la célula de origen, incluidos los marcadores celulares superficiales.1 Aislando los exosomas, normalmente a través de una biopsia líquida, es posible analizar las moléculas constitutivas presentes en los exosomas para extraer conclusiones sobre la salud de sus células, órganos u organismos de origen.2 Esto significa que, en lugar de obtener un riñón de ratón, cortar varias secciones o hacer una inmunoelectrotransferencia y teñir con un marcador fenotípico de enfermedad, es posible cultivar líneas celulares específicas de la enfermedad, aislar los exosomas del medio de cultivo celular condicionado y caracterizar las proteínas, ADN y ARN que se hallen en ellos.3 Un mayor rendimiento, un menor coste y más detalles específicos de la enfermedad relevantes en humanos, son razones para pensar en explorar el mundo de los exosomas. 

Exosomas en enfermedades

Del mismo modo que la mayoría de las células humanas sanas, si no todas, liberan exosomas, también los liberan las células no saludables, bajo estrés o enfermas.  De ello se desprende que el cargamento contenido en los exosomas liberados por dichas células reflejará tal estado no saludable, con estrés o patológico.  De hecho, las biopsias líquidas han confirmado que los exosomas circulantes de pacientes con ciertas enfermedades pueden contener proteínas aberrantes4-6 y ácidos nucleicos patógenos.7, 8 Incluso se ha demostrado que estos estados se transmiten de organismo a organismo tras una transfusión de exosomas.6

Las macromoléculas constituyentes que se encuentran en el interior de los exosomas cambian durante la transición de la salud a la enfermedad para reflejar la homeostasis alterada por la carga patológica9, 10, mientras que el número de exosomas liberados aumenta;11 un fenómeno causado por el aumento del sodio intracelular en lo que podría ser un intento de señalar el estado de sufrimiento celular a las células vecinas. Por lo tanto, aislar y caracterizar exosomas de células y tejidos de una patología conocida puede arrojar luz no solo sobre la función celular de esos mensajeros celulares, sino también sobre la identidad de posibles objetivos terapéuticos que anteriormente no estaban definidos.12

Recapitulación de enfermedades in vitro

Si bien es cierto que parte de la investigación en exosomas de enfermedades se lleva a cabo directamente a partir de muestras de fluido derivadas del paciente (orina, saliva, sangre, etc.), existe otro método de analizar el perfil exosomal de varias enfermedades.  Se ha demostrado que las líneas celulares en cultivo liberan exosomas en el medio de cultivo y las pruebas apuntan a que los exosomas derivados de líneas celulares y los exosomas derivados de pacientes con diagnóstico similar son comparables.13-17 Las líneas celulares recolectadas en pacientes con una enfermedad determinada parecen mantener su perfil exosomal a lo largo del tiempo, liberando exosomas con la misma composición.  Se han caracterizado varios perfiles de exosomas relacionados con enfermedades,18-23 que permiten extrapolar de los exosomas liberados por líneas celulares a los exosomas derivados de biopsia líquida, lo que permite el uso de muestras de fluido no invasivas o muy poco invasivas como pruebas diagnósticas para biomarcadores exosomales de enfermedad.

Las líneas celulares derivan de muestras de tejidos obtenidas tras una biopsia quirúrgica o una resección de tejido patológico. Algunas líneas celulares específicas de una enfermedad pueden sobrevivir en cultivo durante mucho tiempo debido a la inmortalización espontánea exhibida por las células tumorales, pero también pueden inmortalizarse las células en el laboratorio induciendo la expresión de un oncogén, como E1A.  Las líneas celulares normales o saludables se crean de esta manera.  Por otra parte, las líneas celulares primarias no son inmortales y solo se pueden dividir unas cuantas veces antes de entrar en senescencia o sufrir muerte celular. Por esta razón, las células primarias no constituyen una fuente ideal reproducible de exosomas para el estudio en cultivo, porque su preparación no se puede controlar ni replicar adecuadamente.  Las buenas prácticas dictan que deben compararse líneas celulares suficientemente similares, de forma que tan solo el estado patológico influya en el perfil exosomal; para que los datos sean interpretables deben compararse exosomas producidos por una línea celular de melanoma con exosomas producidos por una línea celular de melanocitos, no una línea celular de cáncer de colon. 

Se pueden emplear líneas celulares producto de ingeniería para generar exosomas modificando un línea celular existente y alterando o especificando los cargamentos de sus exosomas mediante diversas técnicas de biología molecular y edición genómica.  La conjugación de proteínas fluorescentes o luminiscentes para seguir el tráfico de exosomas y la alteración de la secuencia de las proteínas, ADN o ARN del cargamento para el posterior estudio de la función exosomal, son ejemplos de la utilización de células modificadas para producir exosomas personalizados.24

Análisis fenotípicos: La magia de los marcadores

Generar y aislar exosomas es solo el primer paso para caracterizar la enfermedad in vitro.  El paso siguiente implica caracterizar los exosomas aislados con una serie de marcadores fenotípicos para confirmar la célula de origen del exosoma y para comparar las alteraciones en el perfil de la línea celular en estado patológico con el perfil de la línea celular en estado normal.  Los marcadores fenotípicos que se emplean para caracterizar los perfiles de los exosomas son anticuerpos que reconocen proteínas que se encuentran en la bicapa lipídica y en el compartimento vesicular. 

Si bien no hay consenso sobre un grupo de marcadores que pueda confirmar la identidad de un exosoma, existen varios marcadores que se usan para identificar exosomas.  Marcadores como CD9, C81, MHC Clase 2 son algunos de los marcadores de exosomas comúnmente aceptados.  La identificación de los exosomas también puede hacerse mediante un proceso de exclusión, excluyendo microvesículas positivas para GM130 y calnexina que derivan de partes de la célula de origen que no están implicadas en la biogénesis de exosomas.  Para averiguar los detalles específicos de la célula de origen, los exosomas también se pueden teñir por linaje, utilizando marcadores específicos de línea celular para identificar concretamente el tipo celular por el que fueron liberados.

Las imágenes de citometría de flujo son un método habitual para el análisis de exosomas identificados fenotípicamente que puede confirmar el tamaño y la forma del exosoma, pero también pueden analizarse mediante inmunofluorescencia, microscopía electrónica, inmunoelectrotransferencia o enzimoinmunoanálisis de adsorción.  También puede usarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para caracterizar el componente de ácidos nucleicos de los exosomas.

Caracterizar las enfermedades con exosomas derivados de líneas celulares ofrece varias ventajas en comparación con los métodos tradicionales de análisis de estado patológico, incluidos un mayor rendimiento, un menor coste y un aplicación directa a las patologías humanas.  Para más información sobre los exosomas en la investigación de enfermedades, lea sobre exosomas como nanomateriales para la administración de fármacos.

Referencias:

1. Keerthikumar S, Gangoda L, Liem M, et al. Proteogenomic analysis reveals exosomes are more oncogenic than ectosomes. Oncotarget 2015. doi: 10.18632/oncotarget.3801.

2. Momen-Heravi F, Balaj L, Alian S, et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol Chem 2013;394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.

3. Théry C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol, 2006 Chapter 3: Unit 3.22. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.

4. Emmanouilidou E, Vekrellis K. Exocytosis and Spreading of Normal and Aberrant α-Synuclein. Brain Pathol 2016;26:398-403. doi: 10.1111/bpa.12373.

5. Fraser KB, Rawlins AB, Clark RG, et al. Ser(P)-1292 LRRK2 in urinary exosomes is elevated in idiopathic Parkinson’s disease. Mov Disord 2016. doi: 10.1002/mds.26686. [Epub antes de imprenta]

6. Jeon I, Cicchetti F, Cisbani G, Lee S, et al. Human-to-mouse prion-like propagation of mutant huntingtin protein. Acta Neuropathol 2016. doi: 10.1007/s00401-016-1582-9.

7. Zhang J, Li S, Li L, et al. Exosome and Exosomal MicroRNA: Trafficking, Sorting, and Function. Genom Proteom Bioinform 2015;13:17-24. doi: 10.1016/j.gpb.2015.02.001.

8. Ye SB, Li ZL, Luo DH, et al. Tumor-derived exosomes promote tumor progression and T-cell dysfunction through the regulation of enriched exosomal microRNAs in human naspharyngeal carcinoma. Oncotarget 2014;5:5439-5452.doi:10.18632/oncotarget.2118.

9. Lin J, Li J, Huang B, et al. Exosomes: Novel Biomarkers for Clinical Diagnosis. Sci World Journ 2015;6557086:1-8. doi: 10.1155/2015/657086. 

10. An T, Qin S, Xu Y, et al. Exosomes Serve as Tumour Markers for Personalized Diagnostics Owing to Their Important Role in Cancer Metastasis. J Extracell Ves 2015;4:27522. doi: 10.3402/jev.v4.27522.

11. Zhang X, Yuan X, Shi H, et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. J Hematol Oncol 2015;8:83. doi:  10.1186/s13045-015-0181-x.

12. Valenzuela MM, Ferguson Bennit HR, Gonda A, et al. Exosomes Secreted from Human Cancer Cell Lines Contain Inhibitors of Apoptosis (IAP). Cancer Microenviron 2015;8:65-73. doi: 10.1007/s12307-015-0167-9. 

13. De Toro J, Herschlik L, Waldner C, Mongini C. Emerging Roles of Exosomes in Normal and Pathological Conditions: New Insights for Diagnosis and Therapeutic Appliations. Front Immuno 2015;6:203. doi:  10.3389/fimmu.2015.00203.

14. Ipas H, Guttin A, Issartel JP. Exosomal MicroRNAs in Tumoral U87 MG Versus Normal Astrocyte Cells. MicroRNA 2015;4:131-145.

15. Skog J, Wurdinger T, van Rijn S, et al. Glioblastoma microvesicle transport RNA and proteins that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Bio 2008;10:1470-1476. doi: 10.1038/ncb1800.

16. Akers JC, Ramakrishnan V, Kim R, et al. miRNA contents of cerebrospinal fluid extracellular vesicles in glioblastoma patients. J Neurooncol 2015;123:205-226. doi:  10.1007/s11060-015-1784-3.

17. Jenjaroenpun P, Kremenska Y, Nair VM, et al. Characterization of RNA in exosomes secreted by human breast cancer cell lines using next-generation sequencing. Peer J 2013;1:e201. doi: 10.7717/peerj.201.

18. Bellingham SA, Coleman BM, Hill AF. Small RNA deep sequencing reveals a distinct miRNA signature released in exosomes from prion-infected neuronal cells. Nucl Acids Res 2012;40:10937-10949. doi: 10.1093/nar/gks832.

19. Belov L, Matic KJ, Hallal S, et al. Extensive surface protein profiles of extracellular vesicles from cancer cells may provide diagnostic sigantures from blood samples. J Extracell Ves 2016;5:25355. doi: 10.3402/jev.v5.25355.

20. Xiao D, Ohlendorf J, Chen Y, et al. Identifying mRNA, MicroRNA and Protein Profiles of Melanoma Exosomes. PLoS One. 2012;7:e46874. doi:10.1371/journal.pone.0046874.

21. Zhong S, Chen X, Wang D, et al. MicroRNA expression profiles of drug-resistance breast cancer cells and their exosomes. Oncotarget 2016. doi: 10.18632/oncotarget.7481. [Epub antes de imprenta]

22. Taylor DD, Gercel-Taylor C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos. Trans. R. So.c Lond. B Biol Sci 2014;369:pii:20130503. doi: 10.1098/rstb.2013.0503.

23. Ogata-Kawata H, Izumiya M, Kuioka D, et al. Circulating Exosomal microRNAs as Biomarkers of Colon Cancer. PLOS one 2014;9:e92921. doi:10.1371/journal.pone.0092921.

24. Hood J. Post isolation modification of exosomes for nanomedicine applications. Nanomedicine 2016;11:1745-1756. doi: 10.2217/nnm-2016-0102.

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