Análisis celular totalmente automatizado mediante citometría de flujo

Resumen

La integración directa del citómetro de flujo CytoFLEX a las estaciones de trabajo automatizadas Biomek serie i permite la automatización completa del procesamiento de muestras y la adquisición de datos.
CytoFLEX, un analizador de sobremesa de tamaño reducido, puede recoger 15 parámetros con alta sensibilidad.
Automatizó la siembra, el tratamiento farmacológico, la tripsinización y la tinción celular para el análisis de la apoptosis y de citotoxicidad
El pipeteo de punta selectiva permitió las diluciones en serie y el procesamiento de placas parciales para estudios de transcurso de tiempo
Dosis y tiempos de respuesta medidos para múltiples compuestos en líneas celulares en suspensión y adherentes

La citometría de flujo es una herramienta potente y ampliamente utilizada para el análisis unicelular, una capacidad esencial para aquellos que estudian poblaciones de células heterogéneas. Sin embargo, la necesidad de que las células estén en suspensiones unicelulares puede dificultar la preparación de las muestras. Esto puede incluir la tripsinización de células adherentes y/o pasos de centrifugación para eliminar los reactivos de tinción. Automatizar estos pasos puede reducir el tiempo en el banco de pruebas y al mismo mejorar la reproducibilidad garantizando un tratamiento consistente (p. ej., las incubaciones de tripsina) en todas las muestras. Además, pasar a un formato basado en placas aumenta el potencial de rendimiento de las muestras.

Aquí mostramos cómo se utilizó la estación de trabajo automatizada Biomek i7 (Figura 1A) para automatizar el flujo de trabajo celular completo para la inducción y el análisis de la apoptosis en dos líneas de cáncer. El instrumento Biomek utilizó su recinto con filtrado HEPA para mantener la esterilidad celular durante las manipulaciones. Además, los instrumentos de la serie i permiten integraciones simples e directas, incluido el citómetro de flujo CytoFLEX configurado con un cargador de placas (Figura 1B) que se utilizo aquí, sin necesidad de transportes robóticos adicionales.

IMAGEN A Y B 

Figura 1. Estación de trabajo automatizada Biomek i7 con filtros HEPA (A) con acceso a un citómetro de flujo CytoFLEX integrado con cargador de placas (B).

Elegimos líneas celulares de leucemia (Jurkat) y carcinoma de colon (HCT116) humanos para demostrar los flujos de trabajo tanto para células en suspensión como adherentes. En ambos casos, se sembraron 25 000 células en placas de 96 pocillos y, transcurridas 24 horas, se utilizó la función de punta selectiva del cabezal multicanal para diluir en serie tres compuestos: estaurosporina, camptotecina y 5-fluorouracilo. Estos inductores de apoptosis se añadieron a las células y se incubaron durante 24-72 horas. Antes de la tinción, se tripsinizaron las células HCT 116 utilizando un dispositivo de calentamiento Peltier en cubierta para incubación y se utilizó el cabezal multicanal para realizar pipeteo repetido a fin de crear una suspensión unicelular (Figura 2). Ambas líneas celulares se incubaron con CellEvent® Caspase-3/7 Green (Life Technologies) para identificar células en proceso de apoptosis, y DRAQ7 (Beckman Coulter) para etiquetar células con membranas celulares comprometidas como medida de muerte celular.

Figura 2 
Figura 2. Células HCT116 tras la tripinización automatizada y la resuspensión.

Las células se identificaron mediante dispersión frontal y lateral, y se midieron las tinciones de apoptosis y muerte celular en los canales de fluorescencia FITC y PC5.5 respectivamente. Se generaron gráficos de análisis con el software Kaluza 1.5. La Figura 3A muestra las células HCT116 viables, apoptóticas y muertas para una dosis alta, media y baja de tratamiento con 5-fluorouracilo a las 48 horas, y la Figura 3B muestra la curva de respuesta a las dosis de 48 horas y los IC50 calculados para los tres compuestos, ilustrando la efectividad de las diluciones en serie automatizadas. La figura 4A muestra la progresión de las células Jurkat a través de la vía de muerte celular en el tiempo después de un tratamiento con 78 nM de camptotecina. El cambio de porcentaje de células en cada condición se representa en la figura 4B. Este desarrollo en el tiempo del fármaco se simplificó mediante el pipeteo de punta selectiva multicanal, lo que permitió que las células se siembren una vez, que las diluciones del fármaco se estamparan en pocillos replicados y que se cosechara un conjunto de pocillos por punto temporal.

 

FIGURA 3 A y B 

Figura 3. A) Gráficos de puntos que muestran poblaciones de células HCT116 que son viables (sin teñir), apoptóticas (positivas en caspasa 3/7) o muertas (positivas en DRAQ7) después de 48 horas de tratamiento con 5-fluorouracilo. Los efectos citotóxicos disminuyen a medida que disminuye la concentración, lo que indica diluciones en serie eficaces. B) Curvas de respuesta de la dosis y valores de IC50 basados en el porcentaje de células HCT116 viables tras el tratamiento de 48 horas con tres inductores de apoptosis.

 

FIGURA 4 A y B 

 

Figura 4. A) Gráficos de puntos que ilustran la progresión de las células Jurkat de viables a apoptóticas y a muertas tras la exposición aumentada a 78 nM de camptotecina. B) El porcentaje de células
en cada población se traza en el tiempo ilustrando el aumento inicial de las células apoptóticas, seguido de un aumento del porcentaje de células muertas.

 

Aunque los reactivos que aquí se utilizaron no requieren lavados, tener la capacidad de integrar directamente centrífugas de microplacas (Figura 1B), lavadoras de placas e incubadoras a los instrumentos de la serie i significa que también se pueden automatizar los flujos de trabajo basados en anticuerpos que discriminan a poblaciones en una mezcla heterogénea de manera sencilla. Además, si las muestras se deben procesar mediante un citómetro de flujo de tubos, se pueden utilizar los pipeteadores Span-8 para procesar rápidamente muestras en tubos o realizar una transferencia final desde las placas a los tubos antes del análisis. Por último, para aplicaciones de alto rendimiento, se puede utilizar el software SAMI EX para programar flujos de trabajo de tinción y de análisis para garantizar un tratamiento consistente entre las placas.

*Datos obtenidos durante el desarrollo.