Automatización completa del flujo de trabajo SISCAPA® utilizando una estación de trabajo de automatización de laboratorio Biomek NXP

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Autores: Morty Razavi1, Michael Kowalski2, Tara Jones-Roe2, Christie Hunter3, Leigh Anderson1, Richard Yip1, Matt Pope1, Terry Pearson1.
Ubicaciones: 1SISCAPA Assay Technologies, Washington DC; 2Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN; 3SCIEX, Redwood City, CA

Resumen

  • En este informe presentamos la primera versión manos libres y totalmente automatizada del flujo de trabajo SISCAPA implementado en una plataforma Biomek NXP de Beckman Coulter.
  • El flujo de trabajo se utilizó para medir los niveles endógenos de cinco proteínas cuya abundancia abarca 8 órdenes de magnitud.
  • El CV total del flujo de trabajo osciló entre el 2,1 % y el 6,7 % para diferentes proteínas.
  • La plataforma es capaz de procesar dos placas de 96 pocillos (192 muestras) a través de la desnaturalización, la digestión tríptica y el enriquecimiento de péptidos SISCAPA, en 4,5 horas o un máximo de 960 muestras al día.

Introducción

Con la creciente aplicación de la investigación translacional de espectrometría de masas (MS), la necesidad de automatizar la preparación de las muestras en un paso previo al análisis por MS se ha vuelto cada vez más importante. Específicamente, los flujos de trabajo de múltiples pasos implicados en los enfoques espectrométricos de masas para la medición de proteínas son a menudo exigentes y laboriosos, lo que requiere un nivel de experiencia muy rara vez presente en los entornos de la investigación traslacional. Para superar este desafío, se ha automatizado la tecnología SISCAPA (estándares de isótopos estables y captura por anticuerpos antipéptidos) para la cuantificación de proteínas específicas.

SISCAPA es un enfoque espectrométrico de inmunomasa en el que se usa un anticuerpo de alta afinidad para un péptido proteotípico específico para enriquecer el analito objetivo de una mezcla de proteínas complejas, como un digerido de plasma humano, y cuantificarlo frente a una cantidad conocida de un estándar interno de isótopos estables. Este flujo de trabajo dirigido permite una cuantificación reproducible en proteínas de abundancia mucho menor a partir de muestras complejas con un rendimiento mucho mayor. El flujo de trabajo utiliza un protocolo de "solo adición" mediante el cual se añaden reactivos líquidos a las muestras durante todo el procedimiento sin ningún paso separativo (por ejemplo, centrifugación, separación cromatográfica larga, etc.). Por lo tanto, el procedimiento de preparación de las muestras se simplifica a una serie de pasos de manipulación de líquidos, que se pueden programar fácilmente en robots de manipulación de líquidos. De hecho, hemos demostrado recientemente que al automatizar el flujo de trabajo SISCAPA, las proteínas de diversa abundancia y tamaño se pueden medir con una precisión entre ejecuciones de ~5  %1.

En este informe presentamos el primer flujo de trabajo SISCAPA 100 % manos libres implementado en una estación de trabajo Biomek NXP (Figura 1). El flujo de trabajo comienza con las muestras de plasma/suero/sangre humanos, los anticuerpos SISCAPA específicos de analitos, los estándares de isótopos estables correspondientes y los reactivos necesarios como material de entrada. El protocolo automatizado lleva las muestras a través de a) la digestión tríptica, b) el enriquecimiento de SISCAPA de los analitos objetivo y c) los procedimientos patentados de lavado y elución de SISCAPA. Los péptidos enriquecidos se eluyen en una placa de elución y se analizan utilizando un espectrómetro de masas QTRAP® 6500 (Figura 1). El protocolo está diseñado para que sea de manos libres y alto rendimiento con una capacidad máxima de 10 placas (960 muestras) por día por robot.

Automatización Nota de aplicación SISCAPA Biomek NXP QTRAP 6500 Figura 1

Figura 1. Estación de trabajoBiomek NXP y sistema QTRAP 6500.

Materiales y métodos

Péptidos, anticuerpos y plasmas

Se eligieron cinco péptidos trípticos proteotípicos sustitutivos para representar las proteínas plasmáticas humanas de tamaño y abundancia variables (Tabla 1). Las versiones estables etiquetadas con isótopos de los péptidos objetivo (endógenos) se sistetizaron utilizando métodos de fase sólida de New England Peptide (MA, EE. UU.). Para los péptidos de estándar de isótopos estables (SIS) se utilizó un isótopo, etiquetado arginina o lisina C-terminal, para proporcionar cambios de masa de +10 amu y +8 amu respectivamente.

Los anticuerpos de alta afinidad específicos para los péptidos objetivo se obtuvieron de SISCAPA Assay Technologies Inc. (Washington DC, EE. UU.). Se obtuvo plasma humano agrupado de BioReclamation Inc. (NY, EE. UU.).

Tabla 1. Lista de analitos.

proteína Intervalo”normal” aproximado (ng/ml) MW (Da) Secuencia de péptidos
Albúmina 35 000 000 - 50 000 000 69 367 LVNEVTEFAK
Apolipoproteína B 400 000 - 1 250 000 515 605 FPEVDVLTK
CistatIna C 600 - 1500 15 799 ALDFAVGEYNK
Receptor soluble de la transferrina 1800 - 4600 84.871 GFVEPDHYVVVGAQR
Mesotelina 10 %–80 % 68 986 LLGPHVEGLK

Automatización Nota de aplicación SISCAPA Flujo de trabajo automatizado Figura 2

Figure 2. Automated SISCAPA workflow.

El flujo de trabajo

El protocolo de digestión de “solo adición” se ha descrito en detalle1 y se resume en la Figura 2. Brevemente, las muestras primero se desnaturalizaron en una mezcla de urea, Trizma y clorhidrato de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) de manera que sus concentraciones respectivas fueran de 9 M, 0,2 M y 0,03 M durante la reacción. Después de la desnaturalización, las muestras se alcalinizaron utilizando 0,06 M de iodoacetamida, se diluyeron en 0,2 M de Trizma a una concentración final de urea de 1 M y se digirieron usando tripsina en una proporción de proteína-enzima de 10:1. Elegimos un tiempo de digestión de 3 horas, como se ha determinado anteriormente para obtener la señal endógena máxima para todas las proteínas en estudio. Se añadieron péptidos SIS antes de la digestión. Después de la digestión, los anticuerpos específicos del ensayo unidos a las esferas magnéticas de proteína G se añadieron a las muestras para capturar el analito endógeno y el péptido SIS correspondiente. Los objetivos péptidos enriquecidos, ahora unidos al anticuerpo, se sometieron luego a una serie de pasos de lavado seguidos por la elución ácida del anticuerpo. Los eluyentes péptidos finales se analizaron entonces mediante un sistema nanoLC™ 425 acoplado a un sistema SCIEX QTRAP 6500.

diseño experimental

El plasma humano agrupado se procesó como 16 réplicas. Los eluidos de ocho de las réplicas se agruparon al final del proceso para evaluar la imprecisión aportada por las mediciones espectrométricas de masas. Las ocho réplicas restantes se procesaron por separado para evaluar el coeficiente de variación (CV) total del flujo de trabajo. Se utilizó la siguiente suma del modelo de cuadrados para calcular la imprecisión aportada por el flujo de trabajo previo implementado en la plataforma Biomek NXP:
CVBiomek2 = CVFlujo de trabajo total2 - CVMS2

Configuración de la estación de trabajo Biomek NXP

El flujo de trabajo SISCAPA se automatizó en una estación de trabajo Biomek NXP con un receptáculo de punta selectiva mejorada (EST) de 96 canales. La funcionalidad de la EST permite el uso de cualquier configuración de puntas, permitiendo así el procesamiento de placas de muestras parciales. La plataforma Biomek se configuró con un agitador orbital y una incubadora de agitación (Inheco, Alemania), así como con un apilador Biomek para que se puedan introducir las puntas de pipeta y las placas de procesamiento adicionales y los reactivos en la plataforma según fuese necesario. Esta capacidad de almacenamiento permitió un flujo de trabajo automatizado 100 % manos libres. La disposición de la plataforma Biomek y la configuración inicial de SISCAPA se muestran en las Figuras 3A y 3B, respectivamente.

Automatización Nota de aplicación SISCAPA Disposición de la plataforma y configuración Figura 3

Figura 3. Diseño de la plataforma Biomek (A) y configuración de SISCAPA (B), incluido el contenido del apilador.

Configuración del espectrómetro de masas

Para cada péptido objetivo, las energías de colisión y los potenciales de desagrupación se optimizaron inyectando 10 μl de solución de 100 fmol/μl de la mezcla de péptidos en el sistema LC-MS/MS y se analizaron utilizando el software Skyline (Universidad de Washington, EE. UU.). La plataforma LC-MS/MS consistió en un sistema nanoLC™ 425 funcionando en modo de microflujo acoplado a un sistema QTRAP 6500 (SCIEX, EE. UU.). Se hizo pasar una alícuota de 15 μl de cada muestra a través de una configuración de trampa-elución en la que se utilizó un gradiente isocrático al 3 % de tampón B (2 min) para purgar las sales a los residuos. A continuación, se conmutó la válvula trampa y se utilizó el gradiente analítico para separar los péptidos en una columna de 2,7 μm HALO Peptide-ES C18 (SCIEX) con un caudal de 10 μl/min. Los péptidos objetivo se separaron utilizando un gradiente analítico de 10 minutos con un 0,1 % de ácido fórmico (FA)/DMSO al 5 % en agua como disolvente A y acetonitrilo al 90 %/DMSO al 5 % en FA al 0,1 % en agua como solvente B. Las proporciones de las áreas de los picos se analizaron utilizando el software MultiQuant™ (SCIEX).

Resultados

El flujo de trabajo que aquí se presenta se diseñó con tres requisitos clave en mente: a) demostrar la precisión de manipulación de líquidos b) que sea totalmente manos libres y c) que sea de alto rendimiento (capaz de procesar ~1000 muestras por día).

Se determinó que los dos pasos clave del flujo de trabajo que afectaron significativamente a la precisión fueron el paso de adición de péptidos SIS y el paso de transferencia de la placa limpia. La adición de péptidos SIS se optimizó manipulando los parámetros de manipulación de líquidos: se aspiró un espacio de aire principal de 5 μl antes de aspirar la mezcla de SIS, y se expulsó el contenido en el líquido sin toque de la punta a una velocidad de 10 μl/s. La placa limpia se introdujo en el procedimiento de lavado para reducir la cantidad de péptidos de fondo no específicos a fin de mejorar la relación señal-ruido y el CV general. La figura 4 demuestra la importancia de introducir la placa limpia durante el procedimiento de lavado.

Automatización Nota de aplicación SISCAPA Limpieza de la placa durante el lavado Figura 4

Figura 4. El cromatograma del péptido ApoB endógeno (azul) y el péptido SIS (rosa) correspondiente con la placa limpia (A) y sin ella (B) en el protocolo.

Los cromatogramas típicos para los cinco objetivos endógenos se muestran en la Figura 5, que ilustra la diferencia en abundancia. El desglose del CV del experimento se presenta en la tabla 2. El CV total del flujo de trabajo osciló entre el 2,1 % y el 6,7 % para diferentes proteínas. De acuerdo con informes anteriores, la imprecisión observada con algunos ensayos (albúmina y sTfR) fue aportada principalmente por las mediciones espectrométricas de masas, haciendo que fuese imposible estimar de manera exacta la muy baja imprecisión debida al propio flujo de trabajo SISCAPA de la Biomek. En los casos en que fue posible medir la imprecisión de la preparación de la muestra secuencia arriba, los resultados oscilaron entre el 3,6 % y el 5,0 % para diferentes proteínas, lo cual incluye la imprecisión debida a variabilidad de la digestión y la imprecisión de la manipulación de líquidos durante el procedimiento SISCAPA.

Automatización Nota de aplicación SISCAPA Cromatogramas Figura 5

Figura 5. Cromatogramas que representan péptidos endógenos y SIS enriquecidos de proteínas que abarcan >8 órdenes de magnitud.

Tabla 2. Análisis del CV. Se utilizaron ocho réplicas técnicas para calcular el CV del flujo de trabajo total. Se agruparon ocho réplicas al final del flujo de trabajo y antes del análisis de MS para calcular el CV de la MS. El CV de la Biomek se estimó utilizando el modelo de suma de cuadrados.


Alb ApoB cc: sTfR Meso
CV de la MS 4,1 % 3,3 % 1,0 % 3,2 % 5,7 %
CV de la Biomek N/D 4,6 % 5,0 % N/D 3,6 %
CV total 2,1 % 5,6 % 5,1 % 2,7 % 6,7 %

Si bien el método automatizado es flexible para acomodar el menor número de muestras que se analizó aquí, el mismo está diseñado para procesar por completo dos placas de 96 pocillos (192 muestras) en 4,5 horas. Realizar cinco ejecuciones consecutivas permitiría procesar 960 muestras por instrumento al día, consiguiendo así el rendimiento que hemos deseado.

Conclusiones

Los resultados indican que el flujo de trabajo automatizado SISCAPA implementado en la plataforma Biomek NXP se puede utilizar para medir con precisión proteínas de diferentes tamaños y concentraciones en plasma. Es importante destacar que este flujo de trabajo fue diseñado para que sea de alto rendimiento y 100 % manos libres por lo que es adecuado para aplicaciones de investigación translacional generalizadas.

Referencias

1. Razavi M, Leigh Anderson N, Pope ME, Yip R, Pearson TW. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 2016, 33:494-502. doi: 10.1016/j.nbt.2015.12.008 (2016)

 

Solo para uso en investigación. No se debe utilizar en procedimientos con fines diagnósticos.