Preguntas sobre flujo de trabajo respondidas: Desafíos con las muestras de tejido FFPE 

La secuenciación de nueva generación (NGS) puede proporcionar un análisis en profundidad de secuencias cortas, lo que podría convertirla en una poderosa herramienta para usar con ácido nucleico aislado de tejido fijado en formalina e incrustado en parafina (FFPE).

Jung Doh, científico sénior de aplicaciones, abordó recientemente diez preguntas comunes sobre el trabajo con el desafiante tejido FFPE en los flujos de trabajo de preparación de muestras para NGS. A continuación se incluyen sus respuestas y consejos para los clientes.

1. ¿Cuándo es el uso de muestras FFPE para NGS una mejor opción que las muestras recién congeladas?

Las muestras recién congeladas o congeladas rápidamente son una gran fuente de ADN, pero son costosas de recolectar y mantener y, por lo tanto, no están ampliamente disponibles. Esta baja disponibilidad impide su uso en estudios retrospectivos de tumores a gran escala, estudios que podrían, en última instancia, impulsar el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. 

Por el contrario, las muestras de tejido fijado con formalina e incrustado en parafina (FFPE) se archivan de forma habitual durante el tratamiento y el cuidado de los pacientes. Según algunas estimaciones, hay de 400 millones1 a más de mil millones de muestras FFPE2 en hospitales y bancos de tejidos en todo el mundo. Muchas tienen anotaciones clínicas (diagnóstico primario, régimen terapéutico, respuesta al fármaco y estado de reincidencia), por lo que se pueden vincular a los resultados clínicos y al seguimiento a largo plazo3.

Para algunos tipos de tejidos tumorales, las muestras FFPE suelen ser la única fuente de ADN4. Estas muestras son las que pueden proporcionar a los investigadores información crucial sobre algunos de los cánceres más raros y otras condiciones5.

2. ¿Puede la NGS con muestras FFPE igualar la calidad de los datos de la NGS con muestras recién congeladas?

Sí, de acuerdo con una preponderancia de la literatura actual. De hecho, el poder de la NGS para analizar un gran número de secuencias cortas podría hacer que sea una tecnología ideal para aplicarla a los ácidos nucleicos fragmentados extraídos de las muestras FFPE6.

En un estudio reciente, p. ej., los investigadores realizaron la secuenciación del exoma completo (WES) de los tumores del estroma gastrointestinal extraídos de muestras recién congeladas (FF) o FFPE. La integridad del ADN FFPE se evaluó con un método modificado de PCR RAPD para ayudar a clasificar las muestras como de alta o baja calidad (HQ/LQ). La producción de bibliotecas de ADN y la captura de exomas eran factibles para ambas clases de FFPE, a pesar de que el rendimiento y el tamaño del inserto de la LQ-FFPE eran menores. La WES arrojó datos de igual calidad de muestras FF y FFPE, con la HQ-FFPE generando una cantidad de datos comparables a las muestras FF7.

Otros estudios han revelado fuertes correlaciones entre los datos de la NGS de las muestras FF y FFPE6, 8, 9, 10, respaldando así la viabilidad de generar bibliotecas y resultados de secuenciación de alta calidad incluso del ADN de baja entrada del tejido tumoral FFPE11.

3.  ¿Afecta el proceso de FFPE al rendimiento y/o calidad del ADN obtenido de los tejidos incrustados?

Puede. Por supuesto, esto no era un problema hace 120 años, cuando el formaldehído (el principal componente de la formalina) se identificó como un fijador superior para preservar las muestras de tejido12. Los patólogos e histólogos han estado fijando tejidos con formalina durante más de un siglo13, pero no fue hasta principios de los años 70 que los investigadores descubrieron que la formalina crea enlaces cruzados entre macromoléculas intracelulares como la proteína y el ADN14.

Otra forma de daño al ADN inducido por la fijación con formalina es la fragmentación, que puede dar lugar a bajas cantidades de plantilla amplificable para amplificación de la PCR15. Los investigadores también creen que el almacenamiento a largo plazo de bloques fijados con formalina puede inducir a la fragmentación debido a la exposición a las condiciones ambientales16,17.

No obstante, numerosos estudios han informado de la viabilidad de utilizar el ADN de muestras FFPE con las tecnologías convencionales basadas en la PCR y NGS5,18,19. Aunque la fragmentación puede ser un factor limitante de velocidad en los enfoques que utilizan amplicones más largos, los investigadores han utilizado con éxito amplicones más cortos de ADN FFPE fragmentado20.

Además, otros investigadores han demostrado que algunas modificaciones inducidas por la formalina se pueden revertir parcialmente21, un proceso que ahora se incluye en muchos kits de extracción de ácido nucleico de material FFPE10. Ejemplo: algunos estudios informan de instancias superiores de artefactos de secuencia en muestras FFPE (principalmente sustituciones de base C:G>T:A)9, 22, 23, 24 mientras que otros han visto pocas evidencias de artefactos5, 25. Independientemente de ello, los artefactos de la secuencia C:G>T:A son causados predominantemente por lesiones del uracilo, y el tratamiento del ADN FFPE con uracil-ADN glicosilasa antes de la amplificación de la PCR reduce significativamente estos artefactos sin afectar a los verdaderos cambios de la secuencia mutacional4.

Además, el proceso de preparación del material FFPE, que incluye el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente, puede generar mutaciones en el ADN y dar lugar a la identificación de falsas variantes de nucleótidos simples (SNV) o inserciones/deleciones (indels). Este daño, sin embargo, parece tener una distribución aleatoria en todos los fragmentos de ADN y se puede corregir eligiendo una alta profundidad de secuenciación. Por lo tanto, los investigadores recomiendan niveles de cobertura de al menos 80× al analizar el material FFPE5.

Por último, el método utilizado para la desparafinización también puede afectar a la amplificabilidad del ADN extraído26. Cuanto más alta sea la temperatura de fusión utilizada, mayor será la posibilidad de desnaturalizar el ADN bicatenario. Sin embargo, si la temperatura es demasiado baja, es posible que la parafina no se funda por completo, reduciéndose así el potencial de producción de ácido nucleico. Diferentes tejidos FFPE pueden requerir diferentes temperaturas y tiempos de fusión de la parafina; el objetivo es lograr un equilibrio aceptable entre la temperatura de fusión y la calidad y el rendimiento del ADN. La temperatura máxima recomendada es de 90 ºC. Temperaturas más altas que la indicada pueden dar como resultado una fracción significativa de ADN monocatenario. Algunos investigadores sugieren que el uso de una temperatura de 75°C durante cinco minutos, aún suficiente para derretir la parafina, preserva el ADN bicatenario5.

4.  ¿Afecta la edad de las muestras FFPE a su capacidad de proporcionar bibliotecas secuenciables?

Por lo general, no lo hace, aunque el éxito podría depender de cómo se fijaron originalmente las muestras, las condiciones en que se almacenaron y el método utilizado para crear las bibliotecas.
En un estudio reciente, muestras de hasta tres años de antigüedad produjeron bibliotecas secuenciables el 94 % de las veces, aunque la tasa de éxito cayó al 50 % para muestras más antiguas (14-21 años)27. Otros investigadores no han encontrado diferencias significativas entre las macromoléculas extraídas de bloques almacenados durante 11-12 años, 5-7 años, o 1-2 años en comparación con los bloques del año actual28, con algunos informes de creación exitosa de bibliotecas de ARN aislado de tejidos FFPE de 20 años de antigüedad6.

5.  ¿Puedo esperar una calidad de secuenciación aceptable de muestras FFPE de 10 a 20 años de antigüedad?

Parece haber una disminución insignificante en la calidad de la secuencia de muestras FFPE de más de una década de antigüedad29, confirmando los hallazgos anteriores de un estudio que usó muestras FFPE de 14 y 18 años de antigüedad25. Algunos atribuyen a la robustez de la tecnología de NGS la posibilidad de realizar análisis moleculares de ADN y ARN en tejidos FFPE que han estado almacenados durante hasta dos décadas6. En cualquier caso, según el propósito del análisis, los ácidos nucleicos recuperados de los tejidos FFPE de más de 40 años se pueden utilizar con éxito para análisis molecular30.

6. ¿Puede la calidad de las muestras de ADN FFPE afectar a las aplicaciones genómicas posteriores?

Puede hacerlo, aunque la pregunta más relevante sería qué tan significativo es. Los investigadores saben desde hace tiempo que el proceso de fijación con formalina puede afectar a las aplicaciones genómicas posteriores debido a los enlaces cruzados del ADN con el ADN y las proteínas (que pueden detener las polimerasas), así como a los enlaces cruzados ADN-ADN que pueden inhibir la desnaturalización.31 Gran parte de la preocupación por la calidad de las muestras de ADN FFPE se ha centrado en la detección de mutaciones, aunque muchas de esas preocupaciones, como los artefactos, las variantes de falso negativo y el rendimiento subóptimo de los algoritmos de llamada de variantes, todavía no se han investigado a fondo, 32 por lo que la importancia de su impacto sigue sin aclararse.

Lo que está claro es que la detección de mutaciones puede verse obstaculizada por la degradación del ADN y la presencia de artefactos de secuencias que pueden interpretarse erróneamente como mutaciones. Y aunque el problema de la degradación se puede abordar utilizando amplicones más cortos en los métodos de detección de la PCR, todavía no se ha encontrado una solución corroborada para el problema de los artefactos de secuencia, con la posible excepción de tratar el ADN FFPE con uracil-ADN glicosilasa antes de la amplificación de la PCR4.

Sin embargo, a pesar de los desafíos actuales, muchos investigadores han utilizado con éxito el ADN FFPE para el análisis del número de copias y la detección de mutaciones mediante la secuenciación dirigida de genes individuales33, 34, así como del exoma completo5, 35 y el genoma completo25. También se ha sugerido que las muestras FFPE se pueden utilizar con éxito en lugar de las muestras recién congeladas para estudios de expresión génica8.

7. ¿Cuánto ADN FFPE se requiere para que la NGS tenga éxito?

La respuesta depende en gran medida del tipo de datos que desee generar. Se ha informado de que las cantidades de entrada de ≤250 ng de ADN FFPE son insuficientes para una cobertura adecuada del exoma35, aunque en un estudio reciente de 99 muestras FFPE, los autores informaron de la secuenciación "exitosa" de exomas de tan solo 16 ng de ADN FFPE de entrada36. Otros estudios han secuenciado muestras de tan solo 10 ng, aunque el éxito del análisis de la secuenciación del genoma completo a partir de 10 ng de ADN FFPE se limitó solo a cambios en el número de copias.37. Además, se han utilizado tan solo 5 ng de ADN de plantilla a partir de especímenes FFPE para generar una biblioteca de fragmentos para el análisis de secuencias, lo que ha dado lugar a un cariograma de número de copia indistinguible de un cariograma generado a partir de 1 mg de ADN de plantilla37.

La mayoría de los investigadores están de acuerdo en que gran parte de este éxito en la secuenciación se debe a la capacidad de la NGS de entregar datos utilizables, incluyendo los cambios de base única, inserciones/deleciones y translocaciones, de los fragmentos relativamente cortos de ADN que se pueden recuperar de los tejidos FFPE29, 38.

8.  ¿Puedo extraer con éxito ARN y/o miARN de muestras FFPE?

Sí. Sin embargo, la secuenciación del ARN a partir de muestras FFPE puede llegar a ser un desafío porque el ARN es menos estable que el ADN. Las muestras FFPE podrían degradarse al compararlas con las muestras de ARN utilizadas en otras aplicaciones, pero es posible obtener lecturas de secuencias de alta calidad del material FFPE para el perfilado de miARN39. Debido a su pequeño tamaño, los miARN pueden ser menos propensos a la degradación y la modificación, por lo que su análisis en especímenes FFPE probablemente proporcione una réplica más precisa de lo que se observaría en tejido fresco que aquel de especies de ARNm. 

Un estudio que incluyó 272 aislamientos independientes de ARN de 17 tipos de tejido y 65 bloques FFPE indicó que los miARN no solo son adecuados sino que probablemente sean analitos superiores para la caracterización molecular de especímenes clínicos archivados en peligro40. Si el objetivo es detectar nuevos miARN, la plataforma preferida será probablemente la NGS, que puede proporcionar la mayor cantidad de datos y no requiere un conocimiento previo de las secuencias que se van a identificar.39.

9.  ¿Puedo utilizar tejido FFPE para detectar ADN vírico de brotes de enfermedades pasadas?

El jurado aún está en esto. Se han desarrollado técnicas novedosas para permitir la detección de secuencias víricas conocidas en muestras de tejido FFPE, que hasta ahora han incluido la recuperación del virus A/H1N1 de la gripe "española" de 1918. Utilizando ARN extraído de una muestra de tejido pulmonar FFPE de una víctima de esa famosa pandemia, el virus se caracterizó y luego se recuperó a través de genética inversa41. Además, se ha utilizado amplificación independiente de la secuencia, combinada con NGS, para detectar nuevos virus de diversas muestras de FFPE, pero aún no está claro si las mismas técnicas se pueden aplicar a la detección de virus conocidos y desconocidos en este tipo de muestras.42, 43, 44.

10. ¿Son igualmente fiables todas las herramientas bioinformáticas para NGS de muestras FFPE?

Aún no. Aunque muchos investigadores ya están anticipando el potencial de la tecnología de secuenciación de tercera generación, todavía no hay un método estándar de referencia ampliamente aceptado para analizar los datos de la NGS45, ni existe una norma acordada para el control de calidad de los datos de secuencias46. Y aunque se han desarrollado una variedad de herramientas de análisis bioinformático para los datos de la NGS, su reproducibilidad todavía tiene que mejorar47.

Por ahora, todas las plataformas de NGS disponibles en el mercado tienen diferentes tipos/tasas de error y los usuarios deberían evaluar y abordar con cuidado cada tipo de error para reducir al mínimo el posible impacto en el análisis posterior de los datos. La aplicación de diferentes estrategias bioinformáticas también puede afectar al análisis de los datos de la NGS, por lo que los usuarios también deben comprender los principios, las ventajas y las limitaciones de esos instrumentos para ayudar a garantizar la máxima confianza en sus resultados46.

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