Un método escalable y automatizable para la extracción de ADNlc

Tipo de contenido: Póster
Autores: Lauren P. Saunders; Antonia Hur; Brittany Niccum; Asmita Patel

Introducción

Las biopsias líquidas representan un área prometedora en las pruebas de cáncer, ya que la toma de sangre es menos invasiva que las biopsias tumorales. El ADN libre de células (ADNlc) presente en la sangre incluye ADN derivado de células cancerosas y biomarcadores de cáncer que pueden detectarse en el ADNlc extraído.

La sangre completa también contiene ADN genómico y se puede eliminar mediante centrifugación, lo que resulta en plasma. El ADNlc está presente en muy pequeñas cantidades en sangre o plasma y, por lo tanto, se requieren mayores cantidades de plasma para muchas aplicaciones. Las extracciones más grandes son más difíciles de automatizar, ya que requieren pasos de pipeteo adicionales.

Aquí presentamos un nuevo kit de extracción de ADNlc y mostramos su compatibilidad con extracciones de 200 μl a 5 ml. Hablamos de la optimización del método y demostramos la automatización en un KingFisher Duo. Este flujo de trabajo también se puede automatizar en una estación de trabajo automatizada Biomek i7. Demostramos que este kit se puede utilizar para NGS y producir resultados comparables a otros kits comerciales.

Química escalable con entradas de 200 μl a 5 ml

Figura 1. Aislamiento de ADN de diversas cantidades de plasma. Se añadieron nucelosomas al plasma para garantizar que haya presente ADN suficiente para pruebas de control de calidad (CC). El kit Apostle Minimax aisló casi todo el ADN de entrada, mientras que el kit 2 aisló menos de volúmenes de plasma más grandes.

Póster genómico ADNlc Química escalable Figura 1

Figure 1

Póster genómico ADNlc Química escalable Figura 2

Figure 2

Figura 2. Aislamiento de ADN de 1 a 5 ml de plasma EDTA. Los rendimientos fueron los más altos con el kit Apostle Minimax para 3-5 ml, y los rendimientos fueron similares en todos los kits a 1 ml.

Flujo de trabajo de Apostle Minimax™

Póster genómico ADNlc Flujo de trabajo Figura 3

Figure 3


Figura 3. Flujo de trabajo de Apostle Minimax. El kit Apostle Minimax implica un paso de lisis y una posterior adición de esferas magnéticas para unir el ADN. Una vez que el ADN está unido, se lava con diversos tampones de lavado y finalmente se eluye de las esferas.

Eliminación de los inhibidores de la PCR y el gADN

Póster genómico ADNlc Inhibidores de la PCR Figura 4

Figure 4

          
Figura 4. Comparación de inhibición de la PCR. Se usaron los cebadores p41 y el kit de cuantificación y control de calidad KAPA hgDNA para estimar el [ADN]. Se compararon muestras sin diluir con muestras diluidas 1:4 para medir el efecto de los inhibidores de la PCR.

Si hay inhibidores de la PCR, la concentración estimada será mayor en muestras más diluidas. Concentraciones similares estimadas de dilución de 1:1 a 1:4 de KAPA son un signo de inhibición baja.

Como tal, Apostle Minimax y el kit 1 tienen baja inhibición y se observa inhibición significativa de la PCR en el kit 2.

 

Póster genómico ADNlc Aumento de las entradas Figura 5

Figure 5


Figura 5. El aumento de las cantidades de entrada genera cantidades crecientes de ADNlc. Los trazados de bioanalizador muestran que el aumento del rendimiento del ADN se debe a las crecientes cantidades de un pico de ADN pequeño. No se observó ningún ADN genómico contaminante. Los picos altos al principio y al final de la traza son marcadores altos y bajos.

Optimización del protocolo

Póster genómico ADNlc Protocolo de optimización Figura 6

Figure 6

Figura 6. Optimización de la proteinasa K. Los cambios en concentración de proteinasa K tienen efectos significativos en el [ADN] final. El aumento de la cantidad de proteinasa K a 150 μl produce un rendimiento significativamente mayor en 5 ml de plasma recogido en tubos de EDTA.

Automatización en KingFisher Duo

La extracción se automatizó en el instrumento KingFisher Duo después de añadir la solución de unión/nanopartículas. La parte automatizada de la extracción duró 37 min.

Póster genómico ADNlc KingFisher Duo

Póster genómico ADNlc Automatización de KingFisher Duo Figura 7

Figure 7

Figura 7. El ADNlc se extrajo de 1 ml de plasma en concentraciones coherentes con las extracciones manuales. Se observó poca variabilidad entre las réplicas (desviación estándar de 1,0).

Automatización en la estación de trabajo automatizada Biomek i7

El kit Apostle Minimax™ es compatible con la automatización del instrumento Biomek i7 Automated Workstation** de Beckman Coulter con KingFisher Presto integrado. Se espera que esta configuración tenga un tiempo de ejecución de 2,5 h. El kit Apostle Minimax™ también se puede automatizar en el Biomek i7 sin la integración de KingFisher y se espera que el tiempo de ejecución sea de aprox. 4,5 h.

Estación de trabajo automatizada de manipulación de líquidos Biomek i7

Nombre de la muestra  Lecturas alineadas por porcentaje  Enriquecimiento de la lectura Uniformidad de la cobertura (porcentaje >0,2*media) Cobertura objetivo a 1x Cobertura objetivo a 20x
EDTA Donante 1 Apostle MiniMax™ 99,80 % 70,10 % 98,40 % 100,00 % 99,90 %
EDTA Donante 2 Apostle MiniMax™ 99,80 % 70,80 % 97,90 % 99,90 % 99,80 %
EDTA Donante 1 Kit 1 99,70 % 67,90 % 97,80 % 100,00 % 99,90 %
EDTA Donante 2 Kit 1 99,80 % 65,10 % 95,70 % 99,90 % 99,70 %
Tubo de ADNlc 1 Donante 1 Apostle Minimax™ 99,80 % 72,10 % 98,60 % 100,00 % 99,90 %
Tubo de ADNlc 1 Donante 2 Apostle Minimax™
99,80 % 71,90 % 98,50 % 100,00 % 99,90 %
Tubo de ADNlc 1 Donante 1 Kit 1 99,80 % 71,10 % 97,50 % 100,00 % 99,80 %
Tubo de ADNlc 1 Donante 2 Kit 1
99,80 % 70,20 % 95,90 % 100,00 % 99,90 %
Tubo de ADNlc 2 Donante 1 Apostle Minimax™ 99,80 % 68,10 % 97,90 % 100,00 % 99,90 %
Tubo de ADNlc 2 Donante 2 Apostle Minimax™
99,80 % 69,60 % 98,40 % 100,00 % 99,90 %
Tubo de ADNlc 2 Donante 1 Kit 1 99,80 % 68,40 % 96,70 % 100,00 % 99,90 %
Tubo de ADNlc 2 Donante 2 Kit 1 99,70 % 67,20 % 96,30 % 100,00 % 99,90 %
Tabla 1. Control de calidad de la ejecución de NGS. Las bibliotecas se prepararon a partir de 25 ng de ADN con el kit de preparación de biblioteca de ADN Accel-NGS 2S Hybpara NGS y se preparó una biblioteca de captura objetivo a partir de esa biblioteca utilizando el panel IDT xGen Pan-cancer. Las bibliotecas se agruparon y ejecutaron en un Illumina NextSeq. Los datos se analizaron mediante enriquecimiento de BWA. Se utilizó el genoma humano UCSC hg19 como genoma de referencia. Las métricas de control de calidad de todas las ejecuciones son buenas y comparables entre los métodos de extracción.

Detección de mutaciones cancerosas

Póster genómico ADNlc Mutaciones detectadas Figura 8

Figure 8

Figura 8. Mutaciones detectadas con diferentes métodos de extracción. Se comparó la NGS del donante 2 (ejecución A EDTA, ejecución B Paxgene y Streck). Las mutaciones detectadas por ambos kits se muestran con las mutaciones solo detectadas o detectadas de forma diferente por los diferentes kits.

Nombre de la muestra  Indels Relación Het/Hom Indel SNV Relación Het/Hom SNV Relación Ts/Tv SNV
EDTA Donante 1 Apostle MiniMax™

108

4,4 374 1,7 2,3
EDTA Donante 2 Apostle MiniMax™ 127 4,5 453 1,9 2,8
EDTA Donante 1 Kit 1 110 4,8 373 1,7 2,3
EDTA Donante 2 Kit 1 126 4.3 452 1,9 2,7
Tubo de ADNlc 1 Donante 1 Apostle Minimax™ 108 3.3 398 1,7 2,6
Tubo de ADNlc 1 Donante 2 Apostle Minimax™
99 3,1 403 1,7 2,2
Tubo de ADNlc 1 Donante 1 Kit 1 108 3.3 401 1,7 2,5
Tubo de ADNlc 1 Donante 2 Kit 1
99 3.3 402 1,7 2,3
Tubo de ADNlc 2 Donante 1 Apostle Minimax™ 115 4,8 410 2,1 2,2
Tubo de ADNlc 2 Donante 2 Apostle Minimax™
112 4.3 434 2,5 2,6
Tubo de ADNlc 2 Donante 1 Kit 1 116 4,8 414 2,1 2,2
Tubo de ADNlc 2 Donante 2 Kit 1 113 4,4 427 2,5 2,6

Tabla 2. Mutaciones detectadas con diferentes métodos de extracción. La detección de los indels y SNV fue similar con ambos métodos de extracción.

Nombre de la muestra  Indels  Relación Het/Hom Indel SNV Relación Het/Hom SNV Relación Ts/Tv SNV
Tubo de ADNlc 1 Donante 2 Apostle Minimax™ Ejecución A 99 3,1 403 1,7 2,2
Tubo de ADNlc 1 Donante 2 Apostle Minimax™ Ejecución B
101 3,4 399 1,7 2,3
Tubo de ADNlc 1 Donante 2 Kit 1 Ejecución A 99 3.3 402 1,7 2,3
Tubo de ADNlc 1 Donante 2 Kit 1 Ejecución B
104 3,5 402 1,7 2,3
Tubo de ADNlc 2 Donante 2 Apostle Minimax™ Ejecución A
112 4.3 434 2,5 2,6
Tubo de ADNlc 2 Donante 2 Apostle Minimax™ Ejecución B
112 4,1 432 2,5 2,7
Tubo de ADNlc 2 Donante 2 Kit 1 Ejecución A 113 4,4 427 2,5 2,6
Tubo de ADNlc 2 Donante 2 Kit 1 Ejecución B 114 4,4 431 2,5 2,7

Tabla 3. Variación de la ejecución. Las bibliotecas duplicadas se secuenciaron para determinar la cantidad de variación entre ejecuciones. Como puede ver, la variación entre las ejecuciones A y B de la misma biblioteca tiene una variación mayor o igual que las ejecuciones observadas para los diferentes métodos de extracción, lo que implica que los dos métodos secuencian igualmente bien con NGS.

Conclusiones

  • El ADN se puede extraer de 200 μl a 5 ml de plasma
  • El kit Apostle Minimax elimina los inhibidores de la PCR presentes en el plasma
  • No hay contaminación genómica presente en el ADNlc extraído
  • La extracción de 1 ml de plasma se puede automatizar en un instrumento KingFisher con rendimientos similares a la extracción manual
  • Se encontró un número similar de mutaciones en plasma canceroso con el kit Apostle Minimax™ y otro kit comercial.

El kit Apostle Minimax™ es un nuevo y versátil Kit de ADNlc que puede extraer de un amplio intervalo de cantidades de muestras y ejecutarse manualmente o en una variedad de sistemas de automatización.

 

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