Un enfoque estandarizado y automatizado para el aislamiento y la caracterización de exosomas utilizando instrumentos Beckman Coulter

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Chad Schwartz, Ph. D., Zach Smith, M.S. Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN 46268

Resumen e introducción

Los exosomas son pequeñas microvesículas, derivadas del endosoma tardío, que en la mayoría de los casos se describe en la literatura como inferior a 120 nm, liberadas por todos los tipos de células, y que se ha demostrado que están implicadas en la metástasis del cáncer.1-3 La caracterización y el análisis de los exosomas constituyen un área de investigación que evoluciona rápidamente, aunque su función biológica aún no se ha dilucidado por completo. Los exosomas contienen proteínas, lípidos y microARN capaces de regular una variedad de genes objetivo. Estudios recientes han sugerido que los exosomas pueden servir como biomarcadores para uso clínico y de diagnóstico en un futuro, no sólo en cáncer sino en muchas otras enfermedades humanas4. Nuevos y emocionantes hallazgos han implicado a los exosomas en las enfermedades cardiovasculares5-7, síndromes autoinmunes8 y trastornos neurodegenerativos como las enfermedades de Alzheimer9 y Parkinson10, además de enfermedades infecciosas como la tuberculosis11, la difteria12 e incluso el VIH13.

Un protocolo mejorado y más eficiente de aislamiento y caracterización de exosomas y otras VE es fundamental para avanzar en este apasionante campo y los expertos han pedido recientemente el establecimiento de métodos normalizados. El aislamiento de VE es particularmente tedioso, requiriendo varias rondas de centrifugación diferencial y un paso de centrifugación de gradiente de densidad para obtener vesículas altamente puras. Los retos a posteriori implican un método estandarizado de perfilado genético del miARN a menudo encapsulado. Aquí describimos un flujo de trabajo que utiliza métodos automatizados de Biomek para la estratificación por centrifugación y el fraccionamiento, la extracción total del ARN y la amplificación y limpieza del ADNc para secuenciación de nueva generación. Los resultados de la NGS (secuenciación de nueva generación) se notifican en líneas celulares de colon benignas y cancerosas.

Materiales y métodos:

Preparación de medios empobrecidos en exosomas:

Medios ultracentrifugados: se añadieron 500 ml de HI-FBS estándar por igual a 6 tubos de centrífuga Beckman Coulter Ultra-Clear de 94 ml (ref.: 345777) con un adaptador que luego se colocaron en un rotor Beckman Coulter Tipo 45 Ti y se centrifugaron a 120 000 x g por 18 horas a 4 ˚C en una ultracentrífuga Beckman Coulter Optima XPN. El sobrenadante de cada tubo se recuperó y alicuotó a 50 ml y se almacenó en el congelador de -20 ˚C para uso futuro. A continuación, se añadió 50 ml de FBS empobrecido por centrifugación a 450 ml de medios MEM y RPMI 1640. Por último, los medios se complementaron con 10 mm de HEPES y 100 U/ml de penicilina-estreptavidina (Gibco).

cultivo celular

Los concentrados congelados de las líneas HCT 116 (colon normal) (ATCC CCL-247) y CCD 841 CoN (carcinoma colorrectal) (ATCC CRL-1790) se descongelaron y suspendieron en los distintos tipos de tampón y se añadieron inicialmente a 6 placas de pocillos de cultivos (Becton Dickinson). Las células se expandieron a medida que alcanzaron la confluencia y se añadieron a matraces T-175 (Greiner). Brevemente, ambas líneas celulares se tripsinizaron, resuspendieron en tampón adecuado y centrifugaron a 750 x g, 10 min, 20 ˚C, en una Beckman Coulter Allegra X-15 R, en un rotor SX4750A. Las células se volvieron a resuspender en el tampón adecuado, y se les añadió 1 ml a los viales y se colocaron en el Vi-CELL para su análisis. A continuación, se añadió 1 ml de las células suspendidas directamente al Vi-CELL y se cuantificaron para obtener el rendimiento y la viabilidad.

Centrifugación diferencial para el aislamiento de exosomas:

Tras la sedimentación celular en la etapa anterior, se filtró el cultivo de células a través de un filtro de 0,45 μm y se centrifugó a 2000 x g durante 20 minutos a 4 ˚C. Luego se centrifugó el sobrenadante a 10 000 x g durante 30 minutos en la ultracentrífuga Optima XPN equipada con un rotor SW 32 Ti para eliminar los residuos celulares. De nuevo, se recuperó el sobrenadante, se filtró a través de una membrana de 0,22 µm y se centrifugó a 100 000 x g durante 90 minutos con un rotor SW 41 Ti en una Optima XPN. En este momento, se aspiró el sobrenadante y se recuperó el sedimento resuspendiendo en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La muestra resuspendida se etiquetó como “crudo” y es estable a -20 ˚C durante un período prolongado.

Centrifugación de gradiente de densidad para refinamiento adicional:

Para purificar aún más la muestra, se utilizó la estación de trabajo de automatización de laboratorio Biomek 4000 de Beckman Coulter para proporcionar un método rápido, consistente y reproducible para la estratificación de un gradiente de densidad por centrifugación con los volúmenes y la densidad que se indican en la Figura 2. La muestra de exosoma crudo a continuación se estratificó en la parte superior del gradiente y se centrifugó a 100 000 x g a 4 ˚C durante 18 horas con un rotor SW 41 Ti y la Optima XPN. El Biomek 4000 se utilizó de nuevo para fraccionar el gradiente tras el paso de centrifugación. Se recogieron fracciones de 1 ml de la parte superior utilizando un seguimiento de nivel de líquido para un total de 13 fracciones, que luego se sedimentaron utilizando un rotor TLA 120.2 en una centrífuga de sobremesa Optima Max-XP. El sedimento resultante se resuspendió de nuevo en PBS, se analizó para el tamaño, y en función de la densidad y el tamaño esperados de los exosomas recuperados, se combinaron las fracciones7-9, se sedimentaron una vez más usando el rotor TLA 120.2 y finalmente se resuspendieron en un pequeño volumen de PBS.

Caracterización de partículas

Las fracciones altamente purificadas se volvieron a analizar en tamaño mediante el Beckman Coulter DelsaMax. Se determinaron los coeficientes de difusión traslacional D e hidrodinámicos Dh a partir de un análisis de autocorrelación de la luz dispersada a 514,5 nm en un Beckman Coulter DelsaMax Pro. Se ejecutaron veinte adquisiciones de DLS, 5 segundos cada una, sin autoatenuación con cortes de radio to y pico de entre 0,5 nm y 150 nm. Los datos se exportaron desde el paquete de software DelsaMax y se colocaron en Origin para realizar los gráficos.

Extracción del ARN.

Se usaron los kits miRNeasy de Qiagen para extraer ARN total de los exosomas altamente purificados de ambas líneas celulares de alta pureza y los exosomas altamente purificados y crudos. El ARN extraído se analizó en un Thermo Scientific NanoDrop 8000 para determinar la concentración y en un Agilent BioAnalyzer Pico Chip para determinar el tamaño.

Preparación de la libería NGS, la secuenciación y el análisis:

Se cuantificó el ARN de los exosomas de cada par de fracciones utilizando el Quant-It RiboGreen (Life Technologies) con un fluorómetro de placas SpectraMax i3 (Molecular Devices). Se convirtieron aproximadamente 100 ng de cada muestra de ARN de exosomas en bibliotecas de ARN pequeño compatibles con Illumina utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño NEBNext para Illumina (New England Biolabs) automatizado en el manipulador de líquidos automatizado Biomek 4000 (Beckman Coulter, Inc.). La selección de tamaño se realizó utilizando la selección de tamaño basada en SPRI. Tras la construcción de las bibliotecas, estas se analizaron en el BioAnalyzer 2100 (Agilent) utilizando un chip HighSensitivity de ADN. A continuación, se secuenciarion las bibliotecas utilizando un Illumina MiSeq con una ejecución de secuenciación de lectura única de 50 ciclos. Tras la ejecución de la secuenciación, los datos se analizaron utilizando la aplicación de ARN pequeño Illumina BasEspace.

Resultados y deliberación

Los exosomas son el subconjunto más pequeño de las vesículas extracelulares, compuesto por tetraspaninas, receptores específicos de células, balsas lipídicas, proteínas y ARN pequeño (Fig. 1). Los exosomas están involucrados en la comunicación de célula a célula y el mensaje encapsulado dentro de su cáscara derivada de lípidos es crítico para la homeostasis. Recientemente, se han investigado los exosomas por sus capacidades terapéuticas como dispositivo de nano-entrega a células enfermas.

Figura 1. Esquema de un exosoma que brota de una célula, amplificado para mostrar los componentes principales.
Figura 1. Esquema de un exosoma que brota de una célula, amplificado para mostrar los componentes principales.

Los exosomas se derivan de muchas fuentes, incluidos casi todos los líquidos corporales, tipos de células y especies; sin embargo, los cultivos celulares siguen siendo un enfoque popular para el estudio de las vesículas extracelulares. El Vi-CELL de Beckman Coulter es un contador de viabilidad automatizado que se utilizó para evaluar el número de células y la viabilidad de las células HCT 116 y CCD 841 CoN. Las células fueron altamente viables al 97,3 % y 98,4 % para las células HCT 116 y CCD 841 CoN, respectivamente (Tabla 1) a una densidad de 1,52 x 108y 0,82 x 108, respectivamente.

Tipo de célula DESCRIPCIÓN DE LA CÉLULA RECUENTO CELULAR Viabilidad
HCT 116 Carcinoma colorrectal 1,52 x 108 97,3 %
CCD 841 CoN Colon normal 0,82 x 108 98,4 %
Tabla 1: Número de células y viabilidad de dos líneas celulares de colon

 

Se requieren varios pasos de centrifugación diferencial y un gradiente de densidad para separar células enteras, residuos celulares, agregados grandes y proteínas solubles de las vesículas de interés. Estos pasos se detallan en la Figura 2. El método experimental sigue dos vías; una en la que el aislamiento del exosoma se termina después del cuarto centrifugado (sedimentación a 100 000 x g) y el otro que pasa por separación de gradiente de densidad y 2 pasos de sedimentación adicionales. El material inicial para ambos protocolos fue igual dado que la entrada de células inicial se proporcionó en correspondencia. Se utilizó la estación de trabajo Biomek 4000 en el flujo de trabajo de gradiente de densidad tanto para estratificar como para separar los medios y fraccionar las muestras para reducir la variabilidad entre procesamientos y disminuir el tiempo de trabajo experimental.

 

Figura 2. Flujo de trabajo de centrifugación típico y configuración del gradiente de iodixanol para la purificación estricta de exosomas a partir de cultivos celulares. Los gradientes se estratificaron y fraccionaron utilizando un Biomek 4000.
Figura 2. Flujo de trabajo de centrifugación típico y configuración del gradiente de iodixanol para la purificación estricta de exosomas a partir de cultivos celulares. Los gradientes se estratificaron y fraccionaron utilizando un Biomek 4000.

Tras el aislamiento, se midieron los exosomas mediante dispersión de luz dinámica utilizando el DelsaMax Core de Beckman Coulter. En todos los casos, los exosomas purificados tenían el tamaño adecuado, entre 30 y 150 nm, pero con algunas proteínas residuales u otras partículas de alrededor de 5 nm. Los datos de los exosomas crudos de HCT 116 se muestran en la (Fig. 3).

Figura 3. Gráfico representativo de los datos de DLS adquiridos a partir de exosomas purificados.
Figura 2. Gráfico representativo de los datos de DLS adquiridos a partir de exosomas purificados.

A continuación, se extrajo, cuantificó y midió el ARN total. Los exosomas contienen una amplia variedad de RNA de diferentes tamaños, lo cual resulta evidente en los trazadores BioAnalyzer (Fig. 4). El ARN tenía picos amplios centrados entre 20 y 30 nucleótidos, lo que sugiere una gran población de miARN, pero también contenía picos representativos de otras especies de ARN como mARN, ARN ribosómico y ARN precursor, según fue detectado por el chip Pico RNA. Sorprendentemente, los ARN obtenidos de los exosomas crudos y los exosomas purificados por gradiente de densidad fueron muy similares en tamaño, pero la concentración del ARN fue significativamente mayor en los primeros respecto a los de gradiente de densidad.

Figura 4. Rastro electroforético del BioAnalyzer de ARN total exosómico derivado de células CCD 841 CoN (arriba) y HCT 116 (abajo) aisladas con (rojo) o sin (azul) un gradiente de densidad.
Figura 4. Rastro electroforético del BioAnalyzer de ARN total exosómico derivado de células CCD 841 CoN (arriba) y HCT 116 (abajo) aisladas con (rojo) o sin (azul) un gradiente de densidad.

El ARN aislado de cada muestra exosómica se preparó en bibliotecas de secuenciación de ARN pequeño compatibles con Illumina utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño NEBNext para Illumina en la estación de trabajo genómica Biomek 4000. Las bibliotecas se cuantificaron utilizando el kit de cuantificación de bibliotecas Illumina de Kapa Biosystems. Se prepararon ARN de crudo (solo ultracentrifugación) y preparaciones de gradiente de densidad de líneas celulares HCT y CCD en bibliotecas de ARN pequeño para secuenciación de nueva generación (NGS) y se secuenciaron en un secuenciador Illumina MiSeq usando un kit de secuenciación v2 de 50 ciclos.

Tras la generación de FASTQ y el recorte de la lectura, se realizó el análisis de secuenciación en BaseSpace utilizando la aplicación SmallRNA, que emplea la alineación BowTie con el genoma de referencia humano hg19 y miRDeep y DESeq2 para expresión diferencial. El ARN exosómico de gradiente de densidad de CCD 841 CoN y HCT 116 generó 678 231 y 600 307 recuentos de lectura PassFilter, respectivamente, mientras que el ARN exosómico crudo de CCD 841 CoN y HCT 116 creó 660 025 y 617 001 recuentos de lectura, respectivamente. El alto número de lecturas y la baja variación entre los conjuntos de datos sugiere que el ARN aislado es robusto y con un rendimiento suficientemente alto para la secuenciación.

Hubo una variación significativa en el tipo de ARN entre líneas celulares y métodos de preparación (Fig. 5). En el gráfico superior, resulta evidente que la abundancia relativa total de miARN es la más baja en el método de preparación de gradiente de densidad de HCT 116, pero que el miARN maduro es realmente el más grande en esta preparación (tercer gráfico). La mayor variación entre los métodos de preparación fue evidente en las células HCT 116. En términos de ARN pequeño, se observaron de manera significativa más exones en la preparación de gradiente de densidad, pero esto se tradujo en GtARN adicional, ARN largo no codificante, ARNpi, ARN precursor, snoARN y snARN para la preparación de crudo. Del ARN abundante, el ARN ribosómico humano es el más prevalente en todas las líneas celulares y en todos los métodos de preparación.

Figura 5. Tabla de abundancia relativa de tipo de ARN tras la generación de FASTQ y el recorte de lectura.
Figura 5. Tabla de abundancia relativa de tipo de ARN tras la generación de FASTQ y el recorte de lectura.

También se trazaron e ilustraron los mapas térmicos de expresión del precursor secuenciado y el miARN maduro (Fig. 6). El gráfico representa la expresión diferencial entre los métodos de preparación dentro de una línea celular. Mediante un análisis adicional, fue evidente que muchas familias de miARN también tuvieron una expresión diferencial significativa entre las líneas celulares de colon cancerosas y normales (Fig. 7). Se determinó que 15 familias de genes se expresaban de manera muy diferente. Cabe destacar que mir-1246, mir-182 y mir-183 estaban todos significativamente regulados al alza (cambio >3,75 veces) en la línea celular de cáncer de colon, CCD 841CoN. De hecho, estas tres familias de genes han sido previamente identificadas como reguladas al alza en el cáncer de colon14-16, alineándose bien con nuestros resultados.

Figura 6. Mapa térmico de expresión diferencial del método de preparación dentro de una única línea celular. Los miARN precursor y miARN maduros están representados en gráficos.
Figura 6. Mapa térmico de expresión diferencial del método de preparación dentro de una única línea celular. Los miARN precursor y miARN maduros están representados en gráficos.

 

Figura 7. Expresión diferencial de recuentos de lectura de miARN dentro de una biblioteca de secuenciación entre células HCT116 y CCD 841 CoN.
Figura 7. Expresión diferencial de recuentos de lectura de miARN dentro de una biblioteca de secuenciación entre células HCT116 y CCD 841 CoN.

 

Conclusiones

La estandarización de los métodos de aislamiento y caracterización es fundamental para el avance de este emocionante campo emergente. La ultracentrifugación de gradiente de densidad es con frecuencia la elección preferida para el aislamiento de exosomas, la cual genera preparaciones de muestras de alta pureza; sin embargo, el flujo de trabajo suele carecer a menudo de reproducibilidad entre laboratorios y entre usuarios. La secuenciación de nueva generación de ARN pequeño es uno de los muchos ensayos a posteriori para la caracterización de los exosomas y la identificación de biomarcadores, pero, nuevamente, los protocolos empleados a menudo varían de forma drástica. Aquí presentamos una solución utilizando la instrumentación de Beckman Coulter para aumentar el rendimiento, el tiempo no dedicado, la reproducibilidad y la exactitud de los resultados (Fig. 8). Los resultados demostraron un flujo de trabajo capaz de producir datos de secuenciación de nueva generación de alto impacto con solo una única ejecución de secuenciación MiSeq, que se puede utilizar para identificar posibles biomarcadores y medir la expresión diferencial con respecto al tipo de muestra.

Figura 8 Flujo de trabajo de exosomas estandarizado de Beckman Coulter.
Figura 8 Flujo de trabajo de exosomas estandarizado de Beckman Coulter.

 

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