Purificación de plásmidos escalable con CosMCPrep

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Autor Dra. Brittany A. Niccum, Beckman Coulter Life Sciences

Resumen

Los plásmidos son esenciales para la mayoría de las construcciones de ingeniería genética. Los plásmidos generalmente se lisan utilizando un protocolo de lisis alcalina, en el que se desnaturaliza todo el ADN y solo el ADN plásmido más pequeño es capaz de recombinarse. Luego, se elimina el ADN genómico con la contaminación de residuos celulares, quedando el ADN plásmido purificado.

Una variedad de diferentes equipos de aislamiento de plásmidos utilizan esta química; sin embargo, muchos de ellos requieren un tiempo de trabajo extenso o tienen límites de entrada baja.

Esta nota de aplicación demuestra la flexibilidad del CosMCPrep, un kit de purificación de plásmidos escalable Se muestra aquí el CosMCPrep para trabajar con volúmenes de hasta 5,5 ml purificando hasta 300 μg de plásmido.

En su capacidad de no solo aislar pequeñas cantidades de plásmidos pequeños para su uso con técnicas moleculares generales, sino también en su capacidad de extraer mayores cantidades de plásmidos para otros posibles usos, el kit es suficientemente flexible para la mayoría de las necesidades de laboratorio.

Materiales y métodos

La cepa DH5α de E. coli conteniendo el plásmido pUC19 se cultivó durante la noche en 1-6 ml s de medio 2xYT (Boston BioProducts) conteniendo carbenicilina (Fisher Scientific). Después de 17 horas de crecimiento, los cultivos se centrifugaron a 10 000 x g durante 2 min en incrementos de 1,5 ml. Los gránulos se resuspendieron en varias cantidades de tampón RE1 y tampón L2, como se describe en la Tabla 1. Las células se lisaron durante 5 minutos, como se describe en el manual del CosMCPrep. Al final de los 5 minutos, se añadieron las cantidades correspondientes de N3 (Tabla 1) para neutralizar la reacción. Las reacciones totales se centrifugaron a velocidad máxima durante 2 minutos para sedimentar el floculente. Se transfirió una proporción del lisado como se describe en la Tabla 2, y se añadió la cantidad de Pur4 + tampón de isoproponol como se describe en la tabla 2. Luego se continuó con el protocolo como se describe en el kit CosMCPrep con los dos lavados de etanol recomendados y 40 μl de tampón RE1 para elución.

Volumen nocturno (ml)  Tampón RE1 (µl)  Tampón L2 (µl) Tampón N3 (µl)
0,8 100 100 100
2 100 200 200
5,5 200 800 800
10 500 1000 1000

Tabla 1. Condiciones de lisis y condiciones de unión para aumentar los volúmenes nocturnos

Volumen nocturno (ml)  Tampón RE1 (µl)  Tampón L2 (µl) Tampón N3 (µl)
0,8 110 10 80 %
2 180 20 132
5,5 660 80 % 488
10 920 145 700

Tabla 2. Condiciones de unión para aumentar los volúmenes nocturnos

Resultados

Se usaron al menos tres réplicas de cada volumen inicial. Al aumentar el volumen nocturno, también se aumentó el rendimiento final del plásmido (Tabla 3 y Figura 1). El rendimiento del plásmido aumenta linealmente con el aumento del volumen nocturno. El rendimiento del plásmido se puede estimar para volúmenes nocturnos mayores utilizando una regresión lineal simple. En la figura 2 hemos estimado que el rendimiento nocturno de 10 ml es de unos 575 μg.

Volumen nocturno  Concentración promedio  Rendimiento promedio (µg) Promedio 260/280 Promedio 260/230
0,8 258 10,3 2,1 2,0
2 1893 74,0 2.2 2,8
5,5 2978 298,0 1,9 2,4

Tabla 3: Rendimiento promedio y pureza del plásmido pUC19 aislado de 3 volúmenes diferentes nocturnos. Los promedios se tomaron de tres réplicas de cada volumen. La pureza que se muestra para cada volumen nocturno es suficiente para aplicaciones de procesamiento basados en PCR. El rendimiento y la pureza del plásmido se evaluó utilizando un NanoDrop (Thermo Fisher Scientific).

CosMCPrep aísla más ADN plásmido con volúmenes de entrada más altos

Purificación de plásmidos escalable utilizando CosMCPrep Figura 1

Figura 1. El rendimiento promedio de las tres réplicas de cada volumen nocturno se muestra con los tres puntos y la desviación estándar de las tres réplicas también se representa como barras de error. Se ha añadido una línea de tendencia que pasa por las tres réplicas. La línea de tendencia tiene un valor R2 de 0,9987.

Estime el volumen nocturno que necesite para sus necesidades de aislamiento de plásmidos

Purificación de plásmidos escalable utilizando CosMCPrep Figura 2

Figura 2. La estimación de las cantidades de plásmido si se utilizaran volúmenes nocturnos más grandes. Las estimaciones se basaron en la regresión lineal simple utilizando la fórmula de la línea de tendencia en la Figura 1.

Conclusiones

Este estudio demuestra la flexibilidad del kit CosMCPrep. El kit no solo es una gran opción para cantidades más pequeñas de plásmidos de grado molecular, sino que también se lo puede escalar para extraer mayores cantidades de plásmidos de grado molecular. La capacidad de hacer una minipreparación así como de una maxipreparación con un solo kit permitiría la libertad de elegir la cantidad de plásmido que se desea extraer sin la molestia de tener dos o más kits a mano en cualquier momento. Además, al utilizar la misma química para toda la extracción de plásmidos, no hay necesidad de aprender más de un flujo de trabajo o preguntarse si las químicas afectan a su plásmido de diferentes maneras.

Consulte el protocolo actual del CosMCPrep para obtener información sobre el producto y una descripción detallada de su uso.

Este protocolo debería utilizarse si se desease una concentración elevada de plásmido.

Las células pueden cultivarse en un medio rico (LB o 2xYT) durante 17-22 horas en tubos individuales con al menos 1 ml de cultivo.

 

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