Linealidad de BSA utilizando ópticas de absorbancia y interferencia

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Dean Clodfelter, M.S., Chad Schwartz, Ph.D., Beckman Coulter Inc., 5350 Lakeview Parkway Dr., Indianapolis, IN 46268

Resumen

Optima AUC es la innovación más reciente de Beckman Coulter y ofrece ventajas significativas como plataforma de ultracentrifugado analítico sobre su predecesora ProteomeLab. Además de la multitud de avances en la experiencia del usuario en la nueva plataforma, los sistemas ópticos, térmicos y de accionamiento de la AUC Optima también se han actualizado de manera significativa, creando una mejor experiencia general para el usuario final en términos de calidad de datos y facilidad de uso. Aquí se utilizó una proteína muy bien caracterizada, albúmina de suero bovino (BSA), como sistema modelo para probar la linealidad de la dependencia de la concentración en el estado de oligomerización.

Introducción

La caracterización de la ultracentrifugación analítica (AUC) de la BSA se remonta a varias décadas y la proteína altamente estable se usa de manera informal como material de referencia para realizar el control de calidad de instrumentos y consumibles. La AUC es una técnica bien conocida que se remonta a la década de 1920, la cual combina la fuerza centrífuga con sistemas ópticos para medir la sedimentación de partículas en el tiempo. La AUC, que se utiliza principalmente para la caracterización de proteínas en términos de tamaño, forma, peso molecular y pureza, se ha vuelto popular en una amplia variedad de aplicaciones, como vectores víricos, agregación, nanopartículas, péptidos, liposomas, conjugados de fármacos, desarrollo y control de formulaciones y estudios termodinámicos. La técnica ofrece ventajas significativas sobre otras herramientas de caracterización biofísica ortogonal, en el sentido de que ese análisis se realiza en solución libre, tiene restricciones de tampón limitadas y se rige por los primeros principios de la termodinámica, de modo que no se requieren estándares.

La serie ProteomeLab de instrumentos de AUC, fabricada por Beckman Coulter, se diseñó originalmente a principios de los años 90 y ha sido la base de todos los análisis de AUC durante las últimas dos décadas y media. A finales de 2016, se lanzó la Optima AUC, y con esa, se agitaron varias aplicaciones nuevas en las mentes de los investigadores a nivel mundial debido a la capacidad de longitud de onda múltiple del instrumento. La AUC se ha utilizado anteriormente para evaluar la pureza, la seguridad y el tiempo de acción de los productos terapéuticos biológicos; sin embargo, la tecnología se está utilizando cada vez más en entornos de control de calidad para ayudar a evaluar las propiedades biológicas generales de los productos farmacéuticos. Esto ha requerido una mayor comprensión de los requisitos reglamentarios de los métodos validados que se aplican para la AUC. La directriz ICH Q2(R1) para la validación de procedimientos analíticos incluye una evaluación de la linealidad de los métodos y de los límites de detección y cuantificación de los métodos. Se evaluaron diluciones seriadas de BSA en PBS para determinar la linealidad del método y la relación señal-ruido como parte de este estudio para evaluar las capacidades de la AUC para respaldar la validación del método de acuerdo con ICH Q2(R1).

Materiales

La albúmina de suero bovino (BSA) se adquirió en Sigma-Aldrich.

La Optima AUC, la ProteomeLab XL I, las celdas analíticas de velocidad de sedimentación de dos sectores, las ventanas de cuarzo, el rotor An-50 Ti y el soporte de torque fueron de Beckman Coulter, Inc.

Métodos

Preparación de muestras de BSA

La solución concentrada de BSA se preparó disolviendo polvo de BSA en PBS a una concentración de 1,5 mg/ml. La BSA se diluyó luego en una dilución en 7 veces en serie con PBS y la densidad óptica de las muestras se midió utilizando un espectrofotómetro Beckman-Coulter DU730 UV/Vis con un camino óptico de 10 mm a 280 nm.

Configuración del instrumento

El tampón de referencia que coincidió con el solvente de muestra se usó como tampón PBS. Las celdas analíticas de 2 sectores se cargaron con 440 μl de tampón tanto de referencia como de muestra. Las células se alinearon en un rotor An-50 Ti y se equilibraron a 20 ˚C durante más de 1 hora. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 42 000 rpm y 20 ˚C, se escanearon 6 horas a Abs 280 nm y para interferencia de Rayleigh en modo continuo. La velocidad de adquisición de la AUC Optima se estableció a 20 segundos por celda para absorbancia con una resolución radial de 10 μm y 20 segundos por celda para interferencia. El método anterior se ejecutó en los instrumentos Beckman Optima AUC y Beckman ProteomeLab XL-I AUC utilizando las mismas muestras ensambladas en las mismas celdas analíticas agitadas después de cada procesamiento.

Figura 1. Gráfico c(s) de 1,5 mg/ml de comparación entre ProteomeLab y Optima AUC   Figura 2. Gráfico c(s) de 1,5 mg/ml de interferencia vs. absorbancia de la Optima AUC
Figura 1. Gráfico c(s) de 1,5 mg/ml de comparación entre ProteomeLab y Optima AUC Gráfico c(s) de coeficientes de sedimentación de la BSA en la misma celda entre instrumentos. El siguiente gráfico demuestra la similitud del valor del coeficiente de sedimentación del monómero de BSA, y la diferencia en especies de orden superior.   Figura 2. Gráfico c(s) de1,5 mg/ml de interferencia vs. absorbancia de la Optima AUC Gráfico c(s) de coeficientes de sedimentación de la BSA en la misma célula utilizando diferentes sistemas ópticos en la Optima AUC. El siguiente gráfico demuestra la similitud en respuesta entre los sistemas ópticos de absorbancia e interferencia de la Optima AUC. Las pequeñas diferencias podrían deberse a un error de carga del usuario (discrepancia del menisco, discrepancia de tampón inexacta, alineación de las celdas) o a defectos en las celdas (arañazos de la ventana, defecto de la pieza central, material residual).

Análisis de datos†

Los datos se extrajeron del controlador de la AUC y se importaron en el SEDFIT 14,7 g4 (www.analyticalultracentrifugation.com). Los datos se analizaron utilizando los parámetros de ajuste que se muestran en la Figura 1. Los datos se extrajeron a GUSSI (http://biophysics.swmed.edu/MBR/software.html) y se graficaron para c(s) con una restricción mínima del valor s a 0,3 S.

Resultados y deliberación

La BSA es una albúmina común que forma multímeros de monómeros, dímeros, trímeros y tetrámeros y que ha sido muy bien caracterizada mediante ultracentrifugado analítico, la cual se utiliza a menudo como prueba de rendimiento del hardware. Para determinar el rendimiento del nuevo instrumento analítico de Beckman Coulter, se utilizó esta proteína para comprobar la linealidad de la respuesta. Se procesaron una serie de concentraciones en ambos instrumentos y estas luego se analizaron mediante un software analítico de uso común para obtener el coeficiente de sedimentación. La distribución resultante del coeficiente de sedimentación se integró para determinar el conjunto multímero.

En la Figura 1, se muestra un gráfico de coeficiente de sedimentación de la BSA a 1,5 mg/ml con seguimiento efectuado utilizando Abs 280 nm tanto en la ProteomeLab como en la Optima AUC. Como era de esperar, la BSA se autoasociará a las cuatro especies independientes de monómeros a tetrámeros en esta concentración, lo que puede explicarse en ambos instrumentos. Sin embargo, como se observa en la Figura 1, la Optima AUC tiene un pico más resuelto a 12,5 S en comparación con la ProteomeLab, el cual está relacionado con la sensibilidad del nuevo instrumento. Dado que la intensidad de la luz fue previamente caracterizada para que sea muy similar en ambos instrumentos, la mayor sensibilidad se correlaciona con un menor ruido sistemático.

El sistema de interferencia de Rayleigh también se utilizó en cada experimento replicado; en la Figura 2 se muestra un gráfico del coeficiente de sedimentación caracterizado por ambos sistemas ópticos. Aquí, se observa que ambos sistemas ópticos generan una respuesta similar.

Para comprender mejor la mayor sensibilidad y precisión de la Optima AUC, se realizaron varios análisis en los experimentos replicados de cada instrumento. En la figura 3, se traza la respuesta del monómero entre concentraciones y se analiza la linealidad de la respuesta. La pendiente de la respuesta del monómero del ProteomeLab tiende a subir a medida que disminuye la concentración, lo que sugiere que la fracción del monómero aumenta a medida que disminuyen las concentraciones. La misma pendiente en la Optima AUC es casi plana, lo que sugiere una respuesta monomérica repetible (~78 % de monómero en todas las concentraciones). Como sabemos que las proteínas se desmontan en concentraciones más bajas, resulta intrigante que la porción de contenido monomérico permanezca estable dentro de estas concentraciones y condiciones de trabajo. Se ha planteado la hipótesis de que la mayor relación señal-ruido de la Optima AUC frente a la de la ProteomeLab (y otros equipos analíticos) permite al instrumento una mejor detección de las especies de orden superior. Cabe señalar que la celda que contenía 0,375 mg/mL de BSA tuvo una filtración y no se analizó.

Figura 3. Linealidad del porcentaje de fracción monomérica   Figura 4. Desviación estándar de la serie de dilución para cada estado oligomérico
Figura 3: Linealidad del porcentaje de fracción monomérica
Porcentaje de especies monoméricas en 6 concentraciones de BSA.
  Figura 4. Desviación estándar de la serie de dilución para cada estado oligomérico
Desviación estándar como porcentaje de especies entre réplicas en cada concentración para la estequiometría.

Además, se observó que la variabilidad en la respuesta fue mayor en la ProteomeLab que en la Optima AUC. La desviación de cada experimento replicado para cada oligómero se representa gráficamente en la Figura 4. En general, la desviación estándar de la respuesta es mucho mayor para la ProteomeLab que para la Optima AUC, lo que sugiere una mayor repetibilidad con el nuevo instrumento.

Finalmente, para ampliar los resultados de linealidad de la respuesta en la figura 3, se realizó un análisis por separado de cada multímero de ambos instrumentos. Estos valores se representan gráficamente en la Figura 5. A concentraciones bajas, hay diferencias significativas en los aparentes estados de asociación entre la Optima AUC y la ProteomeLab. El porcentaje aparente de especies de orden inferior (monómeros, dímeros) es significativamente más alto en la ProteomeLab que en la Optima AUC. De nuevo, se sugiere que la Optima AUC tiene límites de detección y cuantificación más bajos en comparación con la ProteomeLab. Además, para la ProteomeLab, queda claro en el gráfico que el porcentaje de monómeros disminuye, pero que el porcentaje de dímeros y trímeros aumenta linealmente a medida que aumenta la concentración. Sin embargo, la respuesta multimérica en la Optima AUC es una línea plana, lo que sugiere repetibilidad de la respuesta y mayor sensibilidad en todas las concentraciones para cada estado multimérico.

Figura 5. Linealidad de la estequiometría combinada
Figura 5: Linealidad de la estequiometría combinada
Apparent self-association of BSA over a 6-fold dilution series between (a) ProteomeLab and (b) Optima AUC.

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