FBS mermado de exosomas usando la centrifugación Beckman Coulter: La opción rentable y uniforme

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Chad Schwartz Ph.D. | Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN 46268

Resumen e introducción

Los exosomas son pequeñas microvesículas, derivadas del endosoma tardío, que en la mayoría de los casos se describe en la literatura como inferior a 120 nm, liberadas por todos los tipos de células, y que se ha demostrado que están implicadas en la metástasis del cáncer.1-3 La caracterización y el análisis de los exosomas constituyen un área de investigación que evoluciona rápidamente, aunque su función biológica aún no se ha dilucidado por completo. Los exosomas contienen proteínas, lípidos y microARN capaces de regular una variedad de genes objetivo. Estudios recientes han sugerido que los exosomas pueden servir como biomarcadores para uso clínico y de diagnóstico en un futuro, no sólo en cáncer sino en muchas otras enfermedades humanas4. Nuevos y emocionantes hallazgos han implicado a los exosomas en las enfermedades cardiovasculares5-7, síndromes autoinmunes8 y trastornos neurodegenerativos como las enfermedades de Alzheimer9 y Parkinson10, además de enfermedades infecciosas como la tuberculosis11, la difteria12 e incluso el VIH13.

Gran parte de la investigación de los exosomas implica la utilización de una plataforma de cultivo celular, aunque los exosomas se aíslan habitualmente de otros fluidos corporales como el plasma, el suero, la orina o la leche materna. En el cultivo celular, normalmente se incorpora suero bovino fetal (FBS) en el medio, a pesar de que el FBS contiene un nivel extremadamente alto de vesículas extracelulares bovinas innatas, que complican los análisis posteriores. Recientemente, en la comunidad de investigación se ha puesto énfasis en la importancia de reducir los exosomas contaminantes de los medios de cultivo celular14. Para eliminar los exosomas bovinos del FBS, los investigadores acuden habitualmente a la ultracentrifugación debido a la sencillez y eficiencia del proceso. En este proceso, grandes volúmenes de FBS pueden centrifugarse fácilmente a altas velocidades para eliminar las vesículas extracelulares nativas, típicamente en una centrifugación nocturna. Sin embargo, existen productos disponibles comercialmente que pre-acondicionan los medios de cultivo para eliminar los exosomas y otras microvesículas. El proceso descrito aquí es exclusivo y depende del fabricante, pero a menudo es muy costoso en comparación con la adquisición de FBS. Aquí explicaremos el proceso de para la “elaboración casera” de FBS sin exosomas mediante ultracentrifugación y compararemos la viabilidad celular y el porcentaje de eliminación de los medios de dos líneas celulares separadas después del tratamiento con diferentes tipos de medio. También se tratarán formas sugeridas de aislar exosomas del cultivo celular con un ejemplo de protocolo de centrifugación.

Materiales y métodos

Los medios de cultivo se prepararon de tres formas diferentes.

  • Medios adquiridos: se añadieron 50 ml de HI-FBS estándar (Gibco) a 450 ml de MEM (Gibco) para las células Jurkat y RPMI 1640 (Gibco) para las células HCT 116. A continuación, los medios se complementaron con 10 mm de HEPES y 100 U/ml de penicilina-estreptavidina (Gibco).
  • Medios ultracentrifugados: se añadieron 500 ml de HI-FBS estándar por igual a 6 tubos de centrífuga Beckman Coulter Ultra-Clear de 94 ml (ref.: 345777) con un adaptador que luego se colocaron en un rotor Beckman Coulter Tipo 45 Ti y se centrifugaron a 120 000 x g por 18 horas a 4 ˚C en una ultracentrífuga Beckman Coulter Optima XPN. El sobrenadante de cada tubo se recuperó y alicuotó a 50 ml y se almacenó en el congelador de -20 ˚C para uso futuro. A continuación, se añadió 50 ml de FBS mermado por centrifugación a 450 ml de medios MEM y RPMI 1640. Por último, los medios se complementaron con 10 mm de HEPES y 100 U/ml de penicilina-estreptavidina (Gibco).
  • Medios mermados: 50 ml de Exo-FBS Se añadió FBS (System Biosciences) mermado de exosomas a los 450 ml de MEM y RPMI 1640. Los medios también se suplementaron con 10 mm de HEPES y 100 U/ml de penicilina-estreptavidina.

Las existencias congeladas de ambas líneas celulares se descongelaron y suspendieron en los tipos de tampón distintos e inicialmente se añadieron a 6 placas de cultivo de pocillos (Becton Dickinson). Las células se expandieron a medida que alcanzaron la confluencia y se añadieron a matraces T-175 (Greiner). Se evaluó la viabilidad con el Vi-Cell de Beckman Coulter en los días 3 y 7 de cultivo con un subcultivo entre ambos. Brevemente, las células HCT 116 se tripsinizaron, resuspendieron en tampón adecuado y centrifugaron a 500 x g, 5 min, 20 ˚C, en un Allegra X-15 R de Beckman Coulter, en un rotor SX4750A. Las células se volvieron a resuspender en el tampón adecuado, y se les añadió 1 ml a los viales y se colocaron en el Vi-CELL para su análisis. A continuación, se añadió 1 ml de las células de suspensión Jurkat directamente al Vi-CELL.

Para el análisis de trazabilidad de nanopartículas (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA) de las fuentes de FBS para cuantificar el mermamiento, se filtraron 12 ml de cada fuente a través de un filtro de 0,22 μm (Millipore) y se agregaron al tubo de centrífuga Ultra-Clear de Beckman Coulter (344059) y se el tubo se colocó en un rotor SW 41 Ti y se centrifugó a 120.000 x g, 2 horas, a 4 ˚C en un Optima XPN de Beckman Coulter. El sobrenadante se aspiró y el sedimento se resuspendió en 100 μl de 1X PBS pH 7,2 (Gibco). Las partículas resultantes se analizaron en una Nanosight v.2.3 (Malvern Instruments).

Los exosomas de interés se aislaron de ambos tipos de células y de las tres condiciones de cultivo utilizando la centrifugación de Beckman Coulter y se caracterizaron por tamaño en el DelsaMax Core de Beckman Coulter. La figura 1A muestra el flujo de trabajo para el aislamiento. Después de obtener células altamente viables, analizadas por el Vi-Cell, se añadieron 40 ml de cultivo celular a tubos cónicos de 50 ml y se colocaron en un rotor SX4750A con adaptadores cónicos de 50 ml en la centrífuga de sobremesa Allegra X-15R y se centrifugaron durante 10 minutos a 750 x g. Posteriormente se recuperó el sobrenadante, se filtró a través de un filtro de 0,45 μm y se centrifugó a 2000 x g durante 20 minutos. A continuación se centrifugó el sobrenadante a 10.000 x g durante 30 minutos en la ultracentrífuga Optima XPN equipada con un rotor SW 32 Ti para eliminar los restos de células. De nuevo, se recuperó el sobrenadante, se filtró a través de una membrana de 0,22 µm y se centrifugó a 100 000 x g durante 90 minutos con un rotor SW 41 Ti en una Optima XPN. Esta vez, se aspiró el sobrenadante y se recuperó el sedimento resuspendiéndolo en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La muestra resuspendida se etiquetó como exosomas crudo y es estable a -20 ˚C durante un período prolongado.

Recuperación y análisis del exosoma celular. Se define un flujo de trabajo para aislar los exosomas de interés usando la centrifugación de Beckman Coulter
Figura 1A: Recuperación y análisis del exosoma celular. Se define un flujo de trabajo para aislar los exosomas de interés usando la centrifugación de Beckman Coulter
Capa de gradiente Densidad estimada (g/ml) Volumen (mL) % iodixanol (0,25 M sacarosa; pH 7,5)
1 1223 3 40
2 1127 3 20
3 1079 3 10
4 1054 2 5

 

Histograma representativo del ensayo de dispersión de luz dinámica DelsaMax que describe los exosomas del tamaño esperado.
Figura 1C: Histograma representativo del ensayo de dispersión de luz dinámica DelsaMax que describe los exosomas del tamaño esperado.

 

Para purificar aún más la muestra, se utilizó la estación de trabajo de automatización de laboratorio Biomek 4000 de Beckman Coulter para proporcionar un método rápido, consistente y reproducible para la estratificación de un gradiente de densidad por centrifugación con los volúmenes y la densidad que se indican en la Figura 1B. La muestra de exosoma crudo a continuación se estratificó en la parte superior del gradiente y se centrifugó a 100 000 x g a 4 ˚C durante 18 horas con un rotor SW 41 Ti y la Optima XPN. El Biomek 4000 se utilizó de nuevo para fraccionar el gradiente tras el paso de centrifugación. Se recogieron fracciones de 1 ml de la parte superior utilizando un seguimiento de nivel de líquido para un total de 13 fracciones, que luego se sedimentaron utilizando un rotor TLA 120.2 en una centrífuga de sobremesa Optima Max-XP. El sedimento resultante se resuspendió de nuevo en PBS, se analizó para el tamaño, y en función de la densidad y el tamaño esperados de los exosomas recuperados, se combinaron las fracciones 6-9, se sedimentaron una vez más usando el rotor TLA 120.2 y finalmente se resuspendieron en un pequeño volumen de PBS. Las fracciones purificadas fueron analizadas de nuevo por Beckman Coulter DelsaMax en cuanto a su tamaño, utilizando una traza representativa de exosomas Jurkat (Fig. 1C).

Resultados

Porcentaje de merma analizado por NTA

El análisis de seguimiento de nanopartículas se realizó en todas las fuentes de FBS. El número de trazas de medios de cultivo mermados por centrifugación y medios disponibles en el mercado fue nominal en comparación con el medio fuente (fig. 2), lo que sugiere que ambos métodos tuvieron éxito en la eliminación de contaminantes y otras partículas en el FBS.

Ensayo de merma del FBS después del tratamiento. Se centrifugaron tres fuentes de FBS. El sedimento resultante se recuperó y analizó para detectar los exosomas contaminantes.
Figura 2: Ensayo de merma del FBS después del tratamiento. Se centrifugaron tres fuentes de FBS. El sedimento resultante se recuperó y analizó para detectar los exosomas contaminantes.

Viabilidad celular del tipo de suero

La viabilidad celular se midió en dos puntos temporales diferentes antes de aislar exosomas para cada línea celular con el Vi-Cell de Beckman Coulter para comprender el efecto de la eliminación de exosomas en la salud celular. El Vi-Cell de Beckman Coulter ofrece una facilidad de uso y reproducibilidad excepcionales de forma automatizada, confiando en la óptica de alta potencia y en la tinción con azul de tripano para el recuento de células y análisis de la viabilidad. Como se indica en la fig. 3, el proceso de merma de los medios tuvo poco o ningún efecto en la supervivencia de las células.

Efecto de la fuente de FBS en la viabilidad celular en dos líneas celulares. Las células Jurkat (A) y HCT 116 (B) se cultivaron durante siete días y se subcultivaron los días 3 y 7. El recuento de células y la viabilidad de estas se midieron para las 3 fuentes de FBS en esos días.
Figura 3: Efecto de la fuente de FBS en la viabilidad celular en dos líneas celulares. Las células Jurkat (A) y HCT 116 (B) se cultivaron durante siete días y se subcultivaron los días 3 y 7. El recuento de células y la viabilidad de estas se midieron para las 3 fuentes de FBS en esos días.

Deliberación

Los exosomas y otras vesículas extracelulares están presentes en altas concentraciones en el suero bovino fetal (FBS), un complemento estándar que se añade a casi todas las condiciones de cultivo celular. A medida que el campo de la investigación de exosomas continúa expandiéndose, cada vez es más importante estandarizar los métodos de merma del FBS en experimentos que utilizan cultivos celulares. El FBS mermado disponible comercialmente cuesta actualmente más del doble que otros FBS de alta pureza inactivados por calor en la mayoría de distribuidores. Para mitigar los altos costes experimentales, se ha proporcionado una solución alternativa con resultados demostrados. El FBS agotado de forma centrífuga retuvo la viabilidad celular durante el cultivo, demostró ser bajo en contaminación de exosomas y otras partículas como se vio con el sondeo por NTA, y proporcionó los medios para purificar adecuadamente los exosomas celulares mediante la centrifugación diferencial y la aclaración por gradiente de densidad.

Referencias

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