Comparación de la calidad de los datos y la resolución óptica del Optima AUC de nueva generación con el ProteomeLab de eficacia demostrada en un sistema de proteínas modelo

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Autor: Julia P Luciano-Chadee | Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN 46268
Chad Schwartz Ph.D. | Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN 46268

Resumen

AUC proporciona un entorno sin matriz que permite la caracterización de estado casi nativo de una amplia gama de moléculas. Nuestro recientemente lanzado Optima AUC es el único instrumento disponible comercialmente equipado con un sistema óptico de alta calidad. Aquí, el nuevo Optima AUC se comparó con el ProteomeLab y se puso a prueba para demostrar una mejor resolución, exactitud, ajuste de datos y precisión con una relación señal-ruido más alta. La nueva Optima AUC amplía el alcance de las soluciones proporcionadas por el AUC y proporciona a los usuarios parámetros de sedimentación macromolecular bien determinados. Los métodos descritos aquí resaltan las ventajas del Beckman Coulter Optima AUC para caracterizar proteínas en diversas concentraciones.

Introducción

Desde su invención en la década de 1920, la ultracentrifugación analítica (AUC) ha sido una herramienta potente en el estudio de las macromoléculas en solución que ha conducido a descubrimientos científicos impactantes1. La AUC proporciona un entorno sin matriz que permite la caracterización casi nativa de proteínas1, vesículas extracelulares2, ácidos nucleicos3, coloides4y nanopartículas5. Los instrumentos de AUC/ProteomeLab XL-A/I de Beckman Coulter son capaces de medir los parámetros de las muestras, monitorizando la interferencia de Raleigh y la absorbancia de UV/Vis uno por uno en un solo experimento.

Nuestro recientemente lanzado Optima AUC posee un sistema óptico mejorado (tabla 1) que prepara al sector para el desarrollo de nuevas aplicaciones y el estudio de sistemas complejos (figura 1). Nuestro nuevo equipo de instrumentación Optima AUC es una potente herramienta para estudiar muestras con alta precisión, resolución y exactitud.

SISTEMAS ÓPTICOS PROTEOMELAB XL-A/XL-I OPTIMA AUC
VELOCIDAD DE ADQUISICIÓN DE DATOS MÁS RÁPIDA ABS: 90 s/celda
INT: 5 s/barrido
ABS: <20 s>
INT: <5 s>
N.º MÁX. DE LONGITUDES DE ONDA 3 20
PRECISIÓN DE LONGITUD DE ONDA +/- 3 nm +/- 0.5 nm
RESOLUCIÓN RADIAL MÁS BAJA 30 μm 10 μm
FRECUENCIA DE LA LÁMPARA DE REPROGRAMACIÓN DE ABSORBANCIA 50 Hz 300 Hz
ESPECIFICACIONES DE LA CÁMARA CCD 2048 x 96 píxeles 2048 × 1088 píxeles
BANDAS DE INTERFERENCIA ≥ _4 bandas/célula ≥ _10 bandas/célula
INTERVALOS DE CONCENTRACIÓN UTILIZABLES ABS: 0,005 - 1,5 mg/ml
INT: 0,025 - 3-4 mg/ml
ABS: 0,005 - ~1-2 mg/ml de hormona luteinizante
INT: 0,025 - ~4-5 mg/ml BSA**
Tabla 1: Comparación de las especificaciones de Optima AUC y ProteomeLab

 

Figura 1. Aplicaciones habilitadas por el análisis de longitud de onda múltiple
  • Nanopartículas
    • Determinación del tamaño de núcleo
    • Carga de fármaco
  • Puntos cuánticos
  • Aptámeros de ARN
  • Polisacáridos
  • Vectores víricos para terapia génica
    • Vacío frente a cápsidas completas
  • Interacción proteína-lípido de membrana
  • Interacciones proteína-proteína
    • Proteínas de fusión (YFP, GFP, SNAP)
    • Hemoproteínas
    • Flavinas
    • Metaloproteínas
  • Interacciones proteína-ácido nucleico
    • Recombinasas
    • Terminasas
    • ATPasas

Materiales

La albúmina de suero bovino (BSA, cat. A7906-10G) se adquirió de Sigma-Aldrich.

El Optima AUC (ref. B86437, C00708), el ProteomeLab XL I (ref. 969341, 969340), las celdas analíticas de velocidad de sedimentación de dos sectores, las ventanas de cuarzo (ref. 392772), el rotor An-60 Ti (ref. 361964) y el soporte de par (ref. 361318) se compraron a Beckman Coulter, Inc.

Métodos

Preparación de muestras de BSA

La solución concentrada de BSA se preparó disolviendo polvo de BSA en PBS a una absorbancia de 1,0 OD a 280 nm. El OD de las muestras se midió utilizando un espectofotómetro Beckman-Coulter DU730 UV/Vis con una longitud de trayectoria de 10 mm. La BSA se diluyó a concentraciones de trabajo de 0,4 y 0,9 OD en PBS.

Configuración del instrumento

El tampón de referencia que coincidió con el solvente de muestra se usó como tampón PBS. Las celdas analíticas de 2 sectores se cargaron con 440 μl de tampón tanto en los sectores de referencia como de muestra. Las células se alinearon en un rotor An-60 Ti y se equilibraron a 20 ˚C durante más de 1 hora. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 42 000 rpm y 20 ˚C, se escanearon 6 horas a Abs 280 nm en modo continuo. El método anterior se ejecutó en los instrumentos Beckman Optima AUC y Beckman ProteomeLab XL-1 AUC utilizando las mismas muestras ensambladas en las mismas celdas analíticas agitadas entre procesamientos.

Análisis de datos†

Los datos se extrajeron del controlador de la AUC y se importaron en el SEDFIT 14,7 g7 (www.analyticalultracentrifugation.com). Los datos se analizaron utilizando los parámetros de ajuste que se muestran en la figura 2. Los datos se extrajeron a GUSSI (http://biophysics.swmed.edu/MBR/software.html) y se graficaron para c(s) con una restricción mínima del valor s a 0,5 S.

Figura 2. Parámetros de ajuste SEDFIT
Figura 2: Parámetros de ajuste SEDFIT

Resultados y deliberación

Se ha realizado un progreso significativo en el análisis de datos mediante la implementación de software nuevo y mejorado. Los paquetes de análisis de datos de hoy en día han maximizado el límite de los sistemas ópticos actuales y se requiere una actualización de hardware para avanzar las herramientas de la comunidad científica6. Por lo tanto, las nuevas especificaciones ópticas del Optima AUC están preparadas para eludir las limitaciones de adquisición de datos y liderar el campo en las grandes innovaciones del AUC.

Para explorar los avances ópticos del nuevo Beckman Optima AUC con respecto al Beckman ProteomeLab XL-1, los mismos conjuntos de datos de BSA se adquirieron en ambos instrumentos y se analizó el coeficiente de sedimentación. Las muestras se procesaron en condiciones idénticas y el análisis de datos se realizó utilizando el software SEDFIT.

Figura 3. Velocidad de sedimentación c(s) de BSA a 0,4 OD.
Figura 3: Velocidad de sedimentación c(s) de BSA a 0,4 OD.

 

A baja concentración, el BSA monomérico y la dimérico tenía un s20,w de 4,29-4,41 y 6,25-6,89,respectivamente, entre los dos instrumentos, pero los datos adquiridos en el nuevo Optima AUC muestran la emergencia de una especie adicional trimérica en 8,18 (Fig.3). Además, como se observa en el trazo azul de la figura 2, los datos recogidos en ProteomeLab muestran un cambio máximo del dímero, lo que sugiere que esta población es probablemente un frotis de la contribución del dímero a 6,89 c(s). No se observa ninguna tercera especie en el ProteomElab. En contraste, Optima AUC muestra las tres poblaciones bien definidas. La comparación de los dos conjuntos de datos indica que el sistema óptico mejorado del Optima AUC es capaz de distinguir las poblaciones escasas dentro de soluciones a baja concentración.

Figura 4. Velocidad de sedimentación c(s) de BSA a 0,9 OD.
Figura 4: Velocidad de sedimentación c(s) de BSA a 0,9 OD.

 

A concentraciones de BSA elevadas, los datos de ambos instrumentos mostraron los tres estados oligomeréricos de BSA (fig.4). Sin embargo, el Optima AUC resuelve los picos con una relación señal/ruido mayor, permitiéndole una mejor distinción de los distintos picos (fig. 4, trazo rojo). En parte, la precisión y exactitud del Optima AUC se debe a la mejora de la resolución radial y a un mejor ajuste del menisco.

La figura 5 es un panel de los perfiles de velocidad de sedimentación y los gráficos residuales de cada conjunto de datos que muestra cada escaneo. El nuevo instrumento es 4-5 veces más rçapido que el ProteomeLab debido a la mayor frecuencia de la lámpara de reprogramación de absorbancia. El Optima obtuvo tres veces más puntos de datos por escaneo en comparación con el ProteomeLab. Esto se debe a la elevación de la resolución radial de 30 μm a 10 μm (tabla 1). Lo más importante es que, como se ilustra en el rango de trazado térmico, el Optima AUC rindió mejor, produciendo menos variación del máximo residual y un ajuste de datos más preciso.

Figura 5. Gráficos residuales de (A) 0,4 OD en Optima AUC (B) 0,9 OD en Optima AUC (C) 0,4 OD en ProteomeLab (D) 0,9 OD en ProteomeLab.
Figura 5: Gráficos residuales de (A) 0,4 OD en Optima AUC (B) 0,9 OD en Optima AUC (C) 0,4 OD en ProteomeLab (D) 0,9 OD en ProteomeLab.

 

Por último, la precisión y exactitud del nuevo Optima AUC también permite un ajuste de menisco más preciso. Mientras se analizan los datos en SEDFIT y otros programas de análisis de datos, la posición del menisco se establece como parámetro de ajuste. La resolución radial aumentada de las exploraciones experimentales facilita la inspección visual y la definición de la verdadera posición del menisco, como se demuestra en la figura 6. El gráfico A muestra el menisco para la ejecución con baja concentración en el Optima AUC y el gráfico B muestra la misma ejecución en el ProteomeLab. En el Optima AUC, la posición del menisco varía dentro de una precisión de 50 μm, mientras que en el ProteomeLab la posición del menisco varía en un intervalo de 250 μm. La verdadera definición del menisco se mejoró por un factor de 5. Un mejor ajuste del menisco permite mejoras significativas en el ajuste de los datos8 y el perfeccionamiento de este parámetro es un efecto directo de la resolución radial mejorada. La disminución de los artefactos de imagen óptica conlleva parámetros de sedimentación macromolecular bien determinados.

Figura 6. Gráfico SEDFIT de la posición de menisco superpuesto de 0,4 OD en (A) Optima AUC y (B) ProteomeLab.
Figura 6: Gráfico SEDFIT de la posición de menisco superpuesto de 0,4 OD en (A) Optima AUC y (B) ProteomeLab.

 

Conclusiones

AUC es una primera técnica principal. Fundamentalmente, es una herramienta potente que solo se ve afectada por el desarrollo y la mejora de sus sistemas ópticos. Beckman Coulter creó la primera herramienta de caracterización de muestras AUC y continuó liderando el campo con el lanzamiento del Optima AUC. Aquí hemos comentado los avances del nuevo Optima AUC y hemos demostrado que se trata de un sistema óptico mejorado que permite la adquisición de datos con mayor precisión, resolución y exactitud.

Además de las ventajas del nuevo sistema óptico que se han tratado anteriormente, Optima AUC es el único instrumento comercial equipado con la velocidad de adquisición más rápida de 20 segundos por celda, un detector de longitud de onda de 20 longitudes de onda con una gran precisión y un tiempo mínimo, y un intervalo más amplio de concentración de muestras.

† Los resultados generados a partir de los softwares enumerados en esta sección no están garantizados. Consulte las herramientas de software específicas para ver los avisos legales individuales.

Referencias

  1. Howlett, Geoffrey J., Allen P. Minton, and Germán Rivas. "Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly." Current opinion in chemical biology 10.5 (2006): 430-436.
  2. Shulman S. The determination of sedimentation constants with the oil-turbine and spinco ultracentrifuges. Arch Biochem Biophys. 1953; 44: 230–240.
  3. Falabella, James B., et al. "Characterization of gold nanoparticles modified with single-stranded DNA using analytical ultracentrifugation and dynamic light scattering." Langmuir 26.15 (2010): 12740-12747.
  4. Diaz, Leosveys, Caroline Peyrot, and Kevin J. Wilkinson. "Characterization of polymeric nanomaterials using analytical ultracentrifugation." Environmental science & technology 49.12 (2015): 7302-7309.
  5. Plascencia-Villa, Germán, et al. "Analytical Characterization of Size-Dependent Properties of Larger Aqueous Gold Nanoclusters." The Journal of Physical Chemistry C 120.16 (2016): 8950-8958.
  6. Cölfen, Helmut et al. “The Open AUC Project.” European Biophysics Journal39.3 (2010): 347-359. PMC. Web. 5 Dec. 2016.
  7. Schuck P. Size distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biofímacos. J. (2000) 78:1606-19.
  8. Zhao, Huaying et al. “Current Methods in Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium Analytical Ultracentrifugation.” Current protocols in protein science / editorial board, John E. Coligan ... [et al.] 0 20 (2013): 10.1002/0471140864.ps2012s71. PMC. Web. 2 Dec. 2016.

 

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