La nueva centrífuga Avanti J-15 mejora la protección de las muestras y maximiza la recuperación de muestras

Tipo de contenido: Nota de aplicación
Autor Julia P Luciano-Chadee | Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN 46268

Resumen

La protección de las muestras es el objetivo final de cualquier flujo de trabajo que intente proporcionar muestras de calidad para procesos posteriores. A menudo, la centrifugación es el primer paso en el procesamiento de materiales biológicos y químicos. La pureza y las cantidades adecuadas de muestra influyen en el resultado científico al mejorar la calidad de los datos y minimizar la necesidad de replicaciones, lo que reduce el tiempo de inactividad. Las nuevas centrífugas Avanti J-15 de Beckman Coulter se diseñaron pensando en estas necesidades. La implementación de la tecnología Ultra Harmonic en la serie Avanti J-15 convierte nuestra centrífuga en ideal para el procesamiento de muestras que requieren perfiles de desaceleración especiales durante la sedimentación o separación. Al centrarse en la protección de las muestras, la serie Avanti J-15 ha reducido la distorsión de las muestras durante la aceleración y la desaceleración, aumentando el rendimiento de las muestras, reduciendo la contaminación y aumentando la eficiencia de la centrifugación.

Introducción

La centrifugación es un paso esencial y principal en muchos flujos de trabajo biológicos y químicos. Se utiliza en una amplia gama de procedimientos, como cultivo tisular, aislamiento de ácidos nucleicos, procesamiento de sangre, purificación de proteínas, aislamiento de virus, transfección y fraccionamiento subcelular. Durante 70 años, Beckman Coulter ha producido centrífugas de alta calidad que han ayudado a progresar en innumerables descubrimientos científicos. Como la centrifugación de sobremesa tradicional considera principalmente el tiempo, la temperatura y la velocidad como pilares del diseño de la centrífuga, Beckman Coulter está revolucionando el mercado con las centrífugas Avanti J-15 de nueva construcción que maximizan la eficiencia y el rendimiento de la separación y sedimentación de muestras con la implementación de la tecnología Ultra Harmonic.

Preparación experimental y alícuotas de muestras bacterianas.
Figura 1. Configuración experimental y alícuotas
de la muestra de bacterias.

 

Durante la desaceleración, múltiples fuerzas actúan sobre una muestra, lo que puede provocar alteraciones de la muestra. La tecnología Ultra Harmonic optimiza la separación de las muestras reduciendo los cambios netos de fuerza aplicada a la muestra, maximizando la cantidad de presencia de la muestra en el sedimento y reduciendo la presencia de contaminantes o materiales no sedimentados en el sobrenadante. La eficacia de la separación es significativamente importante para las muestras que forman sedimentos blandos, menos adherentes y menos compactos, y requieren protocolos modificados en la parada por inercia (sin perfil de rotura) durante la desaceleración. Los experimentos se realizaron para examinar la eficacia relativa de la sedimentación de la serie Avanti J-15 frente a los instrumentos de sobremesa actuales en el mercado durante la preparación de bacterias de E. Coli DH5-alfa electrocompetentes.

Materiales

Las células E. Coli DH5-alfa competentes (cat. C2989K) se adquirieron de New England BioLabs. La solución de glicerol (cat. 536407) se adquirió de Sigma-Aldrich.

El Avanti J-15R (ref. B99517, B99516, B99515, B99514) equipado con rotor JS-4.750 (ref. B77580) y el Allegra 14R§ (ref. A99465) equipado con rotor SX4750 (ref. 392806) se adquirieron de Beckman Coulter.

Métodos

E. Coli DH5-Alfa se cultivó durante la noche a 37 °C mientras se agitaba a 170 RPM. Después del crecimiento nocturno, se permitió que las células se enfriaran en un baño de agua de 4 °C. Se recogió una muestra del cultivo para la medición de la densidad óptica (OD600) utilizando un espectrómetro Beckman-Coulter DU730 UV/Vis con una longitud de trayectoria de 10 mm. La muestra se diluyó en una proporción de 1:3

Los 40 ml de células fueron alicuotados en tubos cónicos de 50 ml y se asignó una muestra a cada instrumento, Avanti J-15R, Allegra X-14R y una unidad de la competencia (Fig. 1).

Cada instrumento se configuró para centrifugar a 3600 x g durante 20 minutos con los perfiles máximos de aceleración y desaceleración para la sedimentación celular inicial. Cada sedimento se lavó en 20 ml de glicerol al 10 % y se centrifugó a 3600 x g durante 20 minutos utilizando el perfil 4 durante la aceleración y la desaceleración para evitar la pérdida de muestras. Después de la centrifugación, se retiró cuidadosamente el sobrenadante y se repitió el paso de lavado de glicerol dos veces. Después del último paso de centrifugación, las células se resuspendieron en 20 ml de 1 x PBS. Se diluyó una alícuota a 1:3 con 1X PBS y el OD600 se midió utilizando el espectrofotómetro DU730 UV/Vis de Beckman-Coulter y se registró.

Resultados y deliberación

Para explorar los avances de la tecnología Ultra Harmonic sobre los modelos actuales, se preparó y procesó una cantidad inicial idéntica de muestras con idénticas configuraciones en las tres unidades. La tabla 1 resume nuestros hallazgos. Mientras que el OD se midió en dilución 1:3, el número de células notificado se normalizó para tener en cuenta la dilución. Tras el crecimiento celular, se midió la densidad óptica inicial de las células y se calculó la densidad celular para que fuera de 1,35 x 109 células/ml. El cálculo de densidad (genomics.agilent.com) utiliza el coeficiente de extinción para E. Coli a partir de la lectura de OD600 tomada con un espectofómetro.

La recuperación celular al final de tres lavados de glicerol se calculó empíricamente y se comparó en las tres unidades. El resultado de la tabla 1 y demuestra claramente que la tecnología Ultra Harmonic ayuda a proteger las muestras y a lograr máxima recuperación.

Instrumento OD
Medición
(dilución 1:3)
Recuperación de células
(células/ml)
(normalizado para tener en cuenta la dilución)
Pérdida de muestras
Cultivo celular inicial 0,56 1,35 x 109 N/D
Avanti J-15R 0,55 1,33 x 109 1,6 %
Allegra X-14R 0,48 1,15 x 109 14
Competencia 0,30 0,73 x 109 46 %

El nuevo instrumento Avanti J-15 dio resultados superiores que demuestran que mejora la separación de las muestras y la eficiencia de sedimentación en comparación con los modelos actuales. Después de varios lavados de glicerol, solo se produjo una pérdida de menos del 2 % de la muestra. Este resultado no solo se determinó matemáticamente, sino que también se observó visualmente. La muestra recuperada del instrumento Avanti J-15 después del paso de sedimentación tiene un sobrenadante claro, en contraste con el Allegra X-14R (Figura 2).

El uso de un instrumento de la competencia provocó una pérdida de muestras de casi el 50%, lo que puede afectar de forma significativa a los flujos de trabajo posteriores. Al lograr una recuperación de muestras menos que ideal, la cantidad de material inicial se agota, lo que da lugar a los laboriosos pasos que implica repetir un experimento. Casi sin quererlo, la caída en la repetibilidad aumenta el coste y la divergencia de los recursos y del personal del laboratorio.

Curiosamente, el Allegra X-14R de Beckman Coulter Inc. proporcionó una eficiencia tres veces mejor en comparación con instrumentos de la competencia, con una protección de las muestras significativa.

No todas las muestras precipitan igual y con la misma eficiencia. Estas muestras se consideran material de sedimento suave porque no compactan bien. Las muestras de sedimento blando son propensas a la pérdida de muestras y suelen centrifugarse con un perfil de aceleración y desaceleración más largo para evitar la alteración de las muestras y maximizar el rendimiento. Los sedimentos blandos están presentes en la naturaleza (por ejemplo, algas) o pueden crearse. El proceso de producción de células electrocompetentes implica una serie de lavados celulares con glicerol. El glicerol es un criopreservante y se sabe que mantiene la osmolaridad y aumenta la eficiencia de la electrotransformación.

Curiosamente, durante el proceso de lavado con glicerol, las células bacterianas también pierden adherencia y se centrifugan en protocolos modificados que requieren perfiles de aceleración y desaceleración a 4, que reducen la alteración de los sedimentos.

Conclusión

La protección de las muestras y lograr un rendimiento máximo son de vital importancia para la investigación. Con la pérdida de muestras, es posible que deba repetirse varias veces un experimento. La separación inadecuada de las muestras de contaminantes puede provocar resultados inexactos. La tecnología Ultra Harmonic perfecciona la aceleración y la desaceleración y mejora la calidad de la separación de las muestras. Por lo tanto, la nueva serie Avanti J-15 está preparada para evitar problemas de pérdida de muestras y maximizar el rendimiento de las muestras.

Los instrumentos Avanti J-15 series se diseñaron con la tecnología Ultra Harmonic. Incorpora características importantes de aceleración y desaceleración, presentes en la ultracentrifugación perfeccionada, a la centrifugación de sobremesa, reduciendo así la alteración de las muestras durante esas horas críticas. Esta tecnología propulsa la centrifugación de sobremesa rutinaria más allá del tiempo, la temperatura y la velocidad. La tecnología Ultra Harmonic maximiza la recuperación de muestras. Con la misma configuración de instrumento, la tecnología de la competencia no pudo obtener la protección de las muestras observada en nuestros modelos. La serie Avanti J-15 mostró un perfil de aceleración y desaceleración mejorado que aumenta la integridad y la protección de las muestras.

Comparación visual entre la muestra con Allegra X-14R y Avanti J-15R.
Figura 2: Comparación visual entre la muestra con Allegra X-14R
y Avanti J-15R.

 

§ El Allegra X-14R y el Allegra X-15R funcionan con una eficacia similar a la velocidad indicada.

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