Caracterización del vector vírico

La terapia celular y génica implica utilizar un vehículo de distribución génica para introducir un tratamiento en el organismo. Muchas empresas de terapia génica están trabajando con virus adenoasociados (Adeno-Associated Virus, AAV) como vehículo de distribución génica preferido. Los AAV son ideales porque estas cápsidas víricas vienen con un gran genoma intrínseco que se puede modificar para llevar una carga terapéutica. Los investigadores tienen que determinar en primer lugar qué porcentaje de sus cápsidas víricas están intactas y, luego, deben averiguar cuántos tipos de cápsidas víricas intactas están completas. Esta carga transgénica es fundamental para el éxito del tratamiento.

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Es de particular importancia que los investigadores comprendan la carga vírica de estas partículas porque es improbable que las partículas víricas que no contienen el gen terapéutico objetivo produzcan actividad terapéutica, sino que estas partículas podrían producir reacciones adversas, como una respuesta alérgica. Los investigadores necesitan conocer la calidad y pureza de una preparación vírica determinada y muchos están recurriendo al ultracentrifugado analítico para obtener esta información.

La ejecución de un ultracentrifugado analítico proporciona un valor S, el coeficiente de sedimentación. 

La terapia celular y génica implica utilizar un vehículo de distribución génica para introducir un tratamiento en el organismo. Muchas empresas de terapia génica están trabajando con virus adeno-asociados (Adeno-Associated Virus, AAV) como vehículo de distribución génica preferido. Los AAV son ideales porque las cápsides víricas pueden modificarse para llevar una carga terapéutica. Los investigadores tienen que determinar en primer lugar qué porcentaje de sus cápsides víricas están intactas y, luego, deben averiguar cuántos tipos de cápsides víricas intactas están completas. Esta carga transgénica es fundamental para el éxito del tratamiento.

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Es especialmente importante para los investigadores conocer la carga vírica de estas partículas porque no es probable que las partículas víricas que no contienen el gen terapéutico diana completo produzcan actividad terapéutica, en cambio estas cápsides parciales pueden producir reacciones adversas, como una respuesta inmunogénica. Los investigadores necesitan conocer la calidad y pureza de una preparación vírica determinada y muchos están recurriendo al ultracentrifugado analítico para obtener esta información.

La solución para medir la homogeneidad del vector rAAV, la pureza (y más): analizar partículas víricas en solución.

Los vectores víricos adenoasociados recombinantes (Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors, rAAV) podrían ser muy prometedores para las nuevas terapias génicas que salvan vidas.

Pero, aunque las técnicas clásicas como la dispersión de luz dinámica (Dynamic Light Scattering, DLS) o la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) pueden caracterizar la heterogeneidad y agregación de los rAAV, sencillamente no proporcionan suficiente resolución para cuantificar la homogeneidad y la carga de partículas víricas. Cuando se trata de producir preparaciones de vectores rAAV de calidad clínica, lograr mediciones de alta resolución siempre ha sido un obstáculo.

Como saben los investigadores en terapia génica, con tanto en juego en las primeras fases del desarrollo de productos, es fundamental actuar rápidamente. La adopción del ultracentrifugado analítico hace posible producir vectores rAAV de calidad clínica, a diferencia de las otras tecnologías habituales. 

¿El principal obstáculo? Falta de una técnica cuantitativa de alta resolución para controlar la calidad terapéutica con respecto a:

  • Homogeneidad
  • Pureza
  • Consistencia del producto
  • Plenitud vírica 

La solución ideal: análisis en solución con ultracentrifugado analítico (UCA).

Como han descubierto científicos como los de Genethon, al permitir el análisis sin matriz de preparaciones de vectores de rAAV —independientes del serotipo y del transgén—, la UCA les ayuda a:

  • Determinar el estado del ensamblaje vírico o la homogeneidad 
  • Cuantificar empíricamente la agregación
  • Determinar la contaminación de las subpartículas
  • Cuantificar la masa para medir con precisión la carga genética

Vea este seminario web para saber cómo han utilizado la UCA Christine LE BEC y su equipo de Genethon con el fin de caracterizar con éxito los vectores scAAV y ssAAV, incluida la homogeneidad y la carga de partículas víricas.

 

Productos para caracterizar vectores víricos

Optima AUC Analytical Ultracentrifuge

Optima AUC

La ultracentrífuga analítica de nueva generación utilizada con frecuencia en el control de calidad de vectores víricos para cuantificar la carga porcentual en las cápsidas de AAV 

Enlaces útiles

Métodos analíticos para medir las partículas de AAV vacías y completas

Dado que los enfoques de la terapia génica suelen requerir grandes cantidades de vectores de AAV para su uso clínico, se ha informado de que pocos procesos de fabricación proporcionan altas titulaciones y potentes cantidades de productos. El control de la dosis de vectores de AAV se suele establecer mediante métodos de titulación que se basan en la cuantificación del ADN (genoma vírico) o en la expresión transgénica tras la transducción celular (genoma infeccioso). Sin embargo, los lotes de vectores de AAV son generalmente una mezcla heterogénea de partículas vacías (es decir, que no contienen ADN) y de partículas llenas (es decir, que contienen ADN). Por lo tanto, se podría considerar que las partículas vacías son impurezas relacionadas con el producto, lo que puede repercutir en el perfil de inmunogenicidad del producto al administrar altas dosis a los pacientes. Se pueden utilizar diferentes métodos indirectos para establecer la relación entre las partículas de AAV completas y vacías. La cuantificación de las cápsidas completas se realiza mediante el uso de tecnología basada en qPCR. Las partículas totales se pueden evaluar mediante un ensayo ELISA, un análisis espectrométrico, una cromatografía de intercambio iónico o una SDS-PAGE. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones y no son aplicables a todos los serotipos sin realizar un nuevo desarrollo. Utilizando un enfoque de la ultracentrifugación analítica, hemos desarrollado un método para cuantificar de forma simultánea las partículas de AAV vacías y completas, así como las especies intermedias que contienen un genoma de vectores fragmentado o incompleto. Hemos aplicado esta técnica a lotes de AAV de diferentes serotipos, varios tamaños de transgenes y diferentes procesos de producción. Se presentarán varios ejemplos de análisis de vectores de AAV que muestran que el UCA se podría aplicar como prueba de rutina para monitorizar la calidad de los productos de AAV y la consistencia de su fabricación.

Recursos de aplicación