Correlación entre mutaciones encontradas en tejido tumoral FFPE y muestras de ADNlc emparejadas

Tipo de contenido: Póster
Autores: Lauren Saunders y Asmita Patel

Introducción

Las biopsias líquidas representan un área prometedora para facilitar la investigación del cáncer, ya que la toma de sangre es menos invasiva que las biopsias tumorales. El ADN libre de células (ADNlc) presente en la sangre incluye ADN derivado de células cancerosas y biomarcadores de cáncer que pueden detectarse en el ADNlc extraído. Sin embargo, el ADNlc es una visión menos directa de lo que está sucediendo en el tumor y puede tener un perfil genético diferente al del tejido tumoral en sí.

El tejido tumoral normalmente se elimina y almacena como tejido fijado en formol e incrustado en parafina, un proceso que conserva bien las estructuras morfológicas, pero que modifica y degrada químicamente los ácidos nucleicos. A pesar de estas dificultades, este tejido se utiliza a menudo para buscar mutaciones asociadas con el cáncer; sin embargo, no siempre se correlaciona con las mutaciones observadas en el ADNlc.

En este póster presentamos una comparación de muestras de plasma y FFPE coincidentes para determinar cuántas mutaciones se ven en ambos tejidos. También observamos dónde aparecen las discordancias mutacionales en el cromosoma. Las diferentes regiones cromosómicas pueden tener tasas de discrepancia diferentes, y utilizamos esto para extraer conclusiones sobre las mejores ubicaciones cromosómicas para los biomarcadores.

Extracción de ADN y ARN del FFPE con FormaPure XL

FormaPure XL es un kit de Beckman Coulter Life Sciences que mejora las capacidades de lisis para grandes volúmenes de muestras o tejidos muy difíciles de digerir. FormaPure XL puede extraer tanto ARN como ADN, o bien se puede utilizar el lisado completo para extraer un único tipo de ácido nucleico.

Flujo de trabajo de Genomics FormaPure Total XL

Rendimiento de ADN y ARN: Se extrajeron siete cortes de FFPE de 10 µm por triplicado con FormaPure XL y un kit de la competencia. A continuación se muestran los rendimientos de ARN como de ADN. Los rendimientos se midieron utilizando Quant-iT Ribogreen y Picogreen, respectivamente. Los rendimientos variaron con el bloque de tejido, pero se observaron altos rendimientos con ambos kits.

Aislamiento de ADN de sangre completa fresca GenFind V3 Aislamiento de ADN de sangre completa congelada GenFind V3

Calidad del ARN del FFPE. Comparación del ARN de FormaPure XL (rojo) con el ARN del kit 1 (azul). El ARN de FormaPure XL es significativamente mayor que el ARN del kit 1, como puede verse en los trazados y los valores del DV200.

Póster genómico Calidad del ARN Figura 3

Calidad del ADN del FFPE. Comparación del ADN de FormaPure XL (rojo) con el ADN del kit 1 (azul).

Póster genómico Calidad del ADN Figura 4

Extracción de ADNlc del plasma

El ADN se extrajo de 1,5 ml de plasma utilizando el kit Apostle Minimax. Este kit utiliza una química basada en esferas y es automatizable. El flujo de trabajo se muestra a continuación.

Flujo de trabajo Genomics ADNlc Apostle MiniMax

Rendimiento del ADN: El rendimiento se calculó tanto con Quant-iT Picogreen como con KAPA hgQuant utilizando cebadores de 41 pb. La cuantificación coincidió bien con ambos métodos, lo cual es de esperar para fragmentos de ADN de alta calidad.

Póster genómico Rendimiento del ADN Figura 5

Preparación de la biblioteca

Las bibliotecas se crearon a partir de ADN (25 ng) extraído con FormaPure y Apostle Minimax utilizando el kit de librería de ADN Accel-NGS 2S Hyb. Esas bibliotecas (500 ng) se hibridaron al panel IDT xGen Pan-cancer y se amplificaron aún más según se describe en el protocolo.

Póster genómico Biblioteca Figura 6

Tamaño de la biblioteca: Trazados representativos de las bibliotecas Accel-NGS 2S Hyb (izquierda) y traza de muestras agrupadas después de la hibridación y amplificación de IDT. Las bibliotecas están en el intervalo de 200 a 400 pb como se esperaba.

Calidad de la secuencia

La secuenciación se realizó en un NextSeq y se utilizó la amplificación Illumina BWA para crear un armazón e identificar mutaciones.

Tejido de muestra  Tipo de muestra  Lecturas alineadas por porcentaje Enriquecimiento de la lectura Uniformidad de la cobertura (porcentaje >0,2*media) Cobertura objetivo a 1X Cobertura objetivo a 20X
Mama ADNlc 99,70 % 65,00 % 95,40 % 99,30 % 98,80 %
Próstata ADNlc 99,60 % 64,60 % 95,20 % 99,40 % 98,90 %
Pulmón ADNlc 99,70 % 65,20 % 96,10 % 99,80 % 99,40 %
Mama FFPE 99,70 % 58,00 % 97,90 % 99,90 % 99,60 %
Próstata FFPE 99,70 % 70,20 % 96,80 % 99,80 % 99,60 %
Pulmón FFPE 99,70 % 56,50 % 97,60 % 99,60 % 99,00 %

Métricas de secuenciación: Todas las muestras funcionaron bien y la cobertura y las lecturas alineadas se correspondieron bien entre muestras, como se muestra en las métricas de control de calidad indicadas anteriormente.

Comparación de mutaciones de ADNlc y FFPE

Póster genómico Comparación Figura 7

La mutación coincide: Se compararon las mutaciones observadas en muestras emparejadas de ADNlc y FFPE. Según el tipo de cáncer y el tipo de mutación (indel o SNV), solo se observaron hasta un tercio de las mutaciones en un único tipo de muestra. En el ADNlc se observaron más indels, mientras que en los SNV se encontraron más FFPE.

Ubicación genómica de las discrepancias

Frecuencia de las discrepancias a lo largo de los cromosomas: Todas las muestras tuvieron áreas similares de alta y baja discrepancia, por lo que se combinaron las muestras para el análisis. La ubicación de los cromosomas se calculó como un porcentaje para tener en cuenta las diferentes longitudes de cromosomas. Las discrepancias se aunaron en grupos de 10 % del cromosoma.

Póster genómico Discrepancias Figura 8

Discrepancias combinadas: A continuación se muestran las discrepancias medias entre todas las muestras. Las muestras se analizaron utilizando una prueba Student’s T y se agruparon en diferentes niveles. Las regiones cromosómicas analizadas tienen cuatro niveles diferentes de discrepancia de muestra, como se muestra a continuación. Los biomarcadores en la región D (el primer 10-30 %, 40-50 %, 60-80 % o 90-100 % del cromosoma) tienen el número más bajo de discrepancias entre las muestras de ADNlc y FFPE y probablemente se encontrarían con ambos métodos de muestreo.

Póster genómico Discrepancias combinadas Figura 9

Conclusiones

Tanto el FFPE como el ADNlc detectan al menos dos tercios de los indels observados y al menos el 90 % de los SNV observados. Como es más probable que los SNV se encuentren en ambos tipos de tejido, son más adecuados para el uso de biomarcadores si se observan diferentes tejidos. Esto fue cierto para los tres cánceres analizados.

Diferentes regiones del cromosoma presentan diferentes tasas de discrepancia en la detección de mutaciones entre el tejido de plasma y el tejido FFPE. El primer 10-30 %, 40-50 %, 60-80 % y 90-100 % del cromosoma tienen las tasas más bajas de discrepancia y proporcionan las mejores ubicaciones para biomarcadores detectables en ambos tejidos. El trabajo futuro se centrará en aumentar el tamaño de la muestra para reducir aún más las áreas del cromosoma con la mayor probabilidad de una buena detección de mutaciones tanto en plasma como en FFPE.

 

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