Aprovechamiento del Vi-CELL MetAfLEX para monitorizar la actividad metabólica celular

Introducción

    
El vínculo entre la actividad metabólica celular y los niveles de glucosa y lactato en los medios celulares circundantes es un hecho establecido1,2. Sin embargo, resulta difícil detectar de forma reproducible estos cambios relativamente pequeños en el medio. En colaboración con el IRCCS (Instituto de Recuperación y Cura de Carácter Científico) -Instituto de Investigación Farmacológica Mario Negri (IRFMN) de Milán, exploramos la idoneidad de nuestro analizador de medios celulares para detectar pequeños cambios en la actividad metabólica en diferentes tipos de células y entornos experimentales a fin de proporcionar una indicación temprana del resultado del experimento. Esta nota de aplicación detalla cómo se probó nuestro analizador de medios Vi-CELL MetaFLEX y los posibles beneficios para acelerar la investigación del recableado metabólico.

Prácticas experimentales actuales

   
El estudio del metabolismo celular ha crecido exponencialmente durante la última década. Las células ajustan constantemente el flujo de moléculas a través de vías metabólicas en respuesta a las necesidades de energía. Las células cancerosas aumentan el uso de glucosa para respaldar su proliferación, así como los astrocitos y las neuronas cuya función es garantizar una adaptación metabólica adecuada a fin de mantener la actividad neuronal. Por lo tanto, la glicólisis y otras vías metabólicas que controlan la proliferación celular pueden representar objetivos valiosos para intervenciones terapéuticas y procedimientos diagnósticos.

Los avances en tecnología (p. ej., en espectrometría de masas, así como en espectroscopía por resonancia magnética nuclear [RMN] de alta resolución) está abriendo nuevos horizontes en el campo del metabolismo del cáncer en función de su capacidad para explorar diversos procesos metabólicos de manera simultánea (p. ej., la glicólisis y sus vías de ramificación) y sus interacciones. Sin embargo, estos enfoques tecnológicos son complejos y costosos en términos de análisis de datos y equipos requeridos. Antes de iniciar cualquier estudio de metabolómica, hay que tener en cuenta aspectos importantes que van desde la recogida y el almacenamiento de muestras hasta el procesamiento de datos.

La posibilidad de evaluar de forma rápida y fiable mediante técnicas sencillas los cambios en la glicólisis (p. ej., la absorción de glucosa y la producción de lactato) como indicación metabólica temprana del resultado del experimento podría, por tanto, representar una etapa preliminar en la que se podría determinar si el experimento tiene un aspecto positivo y se justifica la realización de investigaciones adicionales. La capacidad de monitorizar los cambios metabólicos en tiempo real durante el cultivo celular sin interferir con el crecimiento celular puede ayudar a diseñar mejor el experimento. Este tipo de enfoque de "triaje" también podría enfocar mejor el uso de las valiosas financiaciones en proyectos de investigación.

Los desafíos de medir la actividad metabólica celular

   
Para células en cultivo, el flujo glicolítico se puede cuantificar midiendo la absorción de glucosa y la excreción de lactato. La monitorización de dichos cambios en medios extracelulares puede llegar a ser difícil debido a los factores de dilución requeridos para permitir la realización de pruebas, etc. Normalmente, la población celular en estos experimentos es pequeña y los cambios mínimos podrían quedar enmascarados por el volumen relativamente grande del medio en que se cultivan las células. El volumen del medio que se vaya a muestrear para monitorización en tiempo real debe ser mínimo a fin de evitar un efecto perjudicial en el crecimiento de las células. Por el mismo motivo, la recogida del medio de cultivo debe ser rápida. El posterior análisis de los metabolitos debería ser sencillo y rápido, evitando los pasos de preparación de la muestra o el almacenamiento que podrían introducir variabilidad no intencionada a los experimentos.

Prueba del Vi-CELL MetaFLEX para monitorización de la actividad metabólica

   
A fin de encontrar una solución adecuada para monitorizar de manera rápida los cambios en la actividad metabólica de las células antes de pasar a estrategias más sofisticadas, IRFMN se acercó a Beckman Coulter para trabajar juntos e investigar si el analizador de medios celulares Vi-CELL MetaFLEX3 se podría utilizar para detectar diminutos cambios en la composición del medio que podrían estar vinculados a cambios en la actividad metabólica de las células.

El resultado deseado de las pruebas era establecer que el MetaFLEX fuese capaz de:

  • Detectar de manera reproducible los pequeños cambios en glucosa y lactato en el medio
  • Detectar a través de una amplia gama de entornos experimentales que van desde células a medios de sangre de ratones utilizados por el IRFMN
  • Producir resultados reproducibles de forma satisfactoria en muestras experimentales previamente congeladas

   
El Vi-CELL MetaFLEX

Vi-CELL MetaFLEX es un analizador de bioanalitos que utiliza tecnología de película gruesa y sensores miniaturizados para medir pH, pO2, pCO2, glucosa, lactato, electrolitos y otros parámetros. Todas las pruebas se realizan solo en 65 μl de muestra.

Resultados de las pruebas

   
Los resultados presentados a través de las siguientes cifras demuestran la capacidad del MetaFLEX de alcanzar los resultados deseados antes mencionados.

Los pequeños cambios en glucosa y lactato se detectaron de forma reproducible en el medio. El MetaFLEX mostró un coeficiente de variación inferior al 4 % para cada analito medido (Figura 1). Los niveles de analito del medio condicionado fueron proporcionales al número de células cultivadas.

Tendencias de concentración de glucosa, lactato y electrolitos en medios de cultivo condicionados (RPMI, 10 % FBS) de células NCI-H1299, 48h después de la siembra. Las tendencias de concentración se calcularon en tres diluciones de células diferentes ( número de células 60*10-3, 120*10-3 y 240*10-3).

Figura 1. Tendencias de concentración de glucosa, lactato y electrolitos en medios de cultivo condicionados (RPMI, 10 % FBS) de células NCI-H1299, 48h después de la siembra. Las tendencias de concentración se calcularon en tres diluciones de células diferentes ( número de células 60*10-3, 120*10-3 y 240*10-3). El número total de células se contabilizó utilizando el contadorMultisizer 4e de Beckman Coulter 48 h después de la siembra. Los datos se expresan como media normalizada del número de células ± DE (tres condiciones biológicas del experimento). Cortesía de Brunelli L. y Caiola E.

 

El MetaFLEX detectó cambios en el nivel de glucosa y lactato en el crecimiento celular in vitro (figura 2).

Las líneas celulares de cáncer de mama se cultivaron en un medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) sin rojo de fenol, suplementado con un 5 % de suero fetal de ternero, glutamina (2 mM) a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %.

   
Figura 2. 
Las líneas celulares de cáncer de mama se cultivaron en un medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) sin rojo de fenol, suplementado con un 5 % de suero fetal de ternero, glutamina (2 mM) a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %. Se detectó la concentración de glucosa y lactato en los medios de cultivo celular a las 18 y 72 h después de la siembra (100 000 células/ml). Cortesía de Paroni G.

 

Las siguientes cifras (Figura 3-6) muestran la medición satisfactoria de lactato y glucosa en una amplia gama de entornos experimentales que abarcan desde medios celulares hasta sangre de ratón.

Las células de cáncer de ovario se cultivaron en un DMEM de alta glucosa + 20 % de FBS + 1 % de Glu y 1 % de p/s. Las células se expusieron a normoxia (37 °C y 20 % de O2) e hipoxia (37 °C y 0,5 % de O2). Las concentraciones de lactato y glucosa se expresaron como mmol/l. Cortesía de Decio A. y Ghilardi C.

   
Figura 3.
Las células de cáncer de ovario se cultivaron en un DMEM de alta glucosa + 20 % de FBS + 1 % de Glu y 1 % de p/s. Las células se expusieron a normoxia (37 °C y 20 % de O2) e hipoxia (37 °C y 0,5 % de O2). Las concentraciones de lactato y glucosa se expresaron como mmol/l. Cortesía de Decio A. y Ghilardi C.

 

Los efectos del LPS se evaluaron en cultivos microgliales primarios obtenidos a partir de médula espinal embrionaria de ratón de 13 días de vida (E13) (para obtener los detalles, consulte De Paola et al., 2012) y se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 40 000 células/cm2 (volumen de medios: 500 μl/pocillo). Se agregó LPS a los medios de cultivo en el 7.º día in vitro (concentración de tratamiento de LPS: 1 μg/ml) durante 24 horas.

   
Figura 4. 
Los efectos del LPS se evaluaron en cultivos microgliales primarios obtenidos a partir de médula espinal embrionaria de ratón de 13 días de vida (E13) (para obtener los detalles, consulte De Paola et al., 2012) y se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 40 000 células/cm2 (volumen de medios: 500 μl/pocillo). Se agregó LPS a los medios de cultivo en el 7.º día in vitro (concentración de tratamiento de LPS: 1 μg/ml) durante 24 horas. Los medios condicionados recogidos (DMEM/F12 suplementados con FBS al 10 % v/v) se analizaron de inmediato para determinar la actividad metabólica. 4 experimentos independientes (tres réplicas/condición para cada experimento). *** p <0,001 vs.="" condición="" de="" control="" (sin="" tratamiento);="" prueba="" t="" no="" emparejada.="" cortesía="" de="" mariani="" a.="" y="" depaola="">

 

Los mioblastos C2C12 semiconfluentes se diferenciaron en miotubos y se cultivaron en un DMEM de baja glucosa (suero de caballo al 2 %). En el momento 0, se añadió insulina (50 nM) al medio de cultivo y, en los momentos indicados se registraron los niveles de glucosa y lactato. Cortesía de Zito E. y Pozzer D.

   
Figura 5.
 Los mioblastos C2C12 semiconfluentes se diferenciaron en miotubos y se cultivaron en un DMEM de baja glucosa (suero de caballo al 2 %). En el momento 0, se añadió insulina (50 nM) al medio de cultivo y, en los momentos indicados se registraron los niveles de glucosa y lactato. Cortesía de Zito E. y Pozzer D.

 

Niveles de electrolitos, glucosa y lactato en muestras de sangre de ratón (65 µl). Los datos se expresan como media ± DE (3 réplicas biológicas). Cortesía de Ricci F.

Figura 6. Niveles de electrolitos, glucosa y lactato en muestras de sangre de ratón (65 µl). Los datos se expresan como media ± DE (3 réplicas biológicas). Cortesía de Ricci F.

 

La figura 7 muestra la reproducibilidad de los resultados de las muestras medidas antes de congelarse y después de descongelarse.

La figura 7 muestra la reproducibilidad de los resultados de las muestras medidas antes de congelarse y después de descongelarse.

Figura 7. El DMEM (Medio Eagle modificado por Dulbecco) de alta glucosa más 20 % de FBS (concentración final de glucosa de 20 mM) se conservó a +4 °C o se congeló a -20 °C durante 24 horas antes de la medición. Las concentraciones de lactato y glucosa se expresaron como mmol/l. Cortesía de Decio A. y Ghilardi C.

 

Conclusión

   
Los investigadores del IRFMN pudieron utilizar el Vi-CELL MetaFLEX para detectar de forma fiable los cambios en la actividad metabólica celular en sus experimentos mediante la monitorización de los pequeños cambios en los niveles de glucosa y lactato. El MetaFLEX permite a los investigadores determinar en una etapa temprana de los experimentos las alteraciones metabólicas que subyacen en el entorno experimental. Armados con esta información, los investigadores pueden reducir el número de experimentos y centrarse en pocas muestras importantes que se pueden analizar ulteriormente mediante tecnologías metabolómicas a nivel de estándar de referencia (p. ej., espectrometría de masas, RMN) o enfoques de biología molecular para realizar una evaluación más completa de las alteraciones metabólicas. Crucial para el éxito de esta validación fue la capacidad del MetaFLEX de detectar de forma fiable cambios muy pequeños en glucosa y lactato. Esto se logró porque utiliza tecnología de sensores de película gruesa para realizar mediciones directas de glucosa y lactato a partir de una muestra de apenas 100 μl (65 μl de muestra más 35 μl de tara).

 

Acerca del IRCCS - Instituto de Investigación Farmacológica Mario Negri (http://www.marionegri.it)

   
El Instituto Mario Negri de Investigación Farmacológica es una organización de investigación biomédica sin fines de lucro. Se fundó en 1961 y comenzó a trabajar en Milán el 1 de febrero de 1963.

El objetivo principal del Instituto es ayudar a defender la salud y vida humanas. Los programas de investigación del instituto abarcan desde el nivel molecular hasta el ser humano en su totalidad, y los hallazgos ayudan a construir la base para el desarrollo de nuevas drogas, y hacer más efectivas las ya existentes.

Las principales líneas de investigación son la lucha contra el cáncer, las enfermedades nerviosas y mentales, las enfermedades cardiovasculares y renales, las enfermedades raras y los efectos tóxicos de los contaminantes medioambientales. El instituto también participa en la investigación sobre el alivio del dolor y la adicción a las drogas.

Paralelas a sus investigaciones biomédicas, el Instituto Mario Negri realiza programas de formación para técnicos de laboratorio e investigadores graduados. Participa en una serie de iniciativas para comunicar información sobre biomedicina a nivel general y con los objetivos específicos de mejorar la práctica del cuidado de la salud y fomentar el uso más racional de los fármacos.

 

Referencias

 

  1. Warburg O. On the origin of cancer cells. ciencia 1956;123(3191):309–314
  2. DeBerardinis RJ, Lum JJ, Hatzivassiliou G, Thompson CB. The biology of cancer: Metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metabolism. 2008;7(1):11–20
  3. Vi-CELL MetaFLEX es un nombre de marca de Beckman Coulter Inc., Brea, EE. UU.
  4. Multisizer es un nombre de marca de Beckman Coulter Inc., Brea, EE. UU.