Replicación de protocolos publicados

En la investigación, a menudo es necesario replicar las condiciones de funcionamiento que observa en los protocolos publicados. Al revisar estos protocolos, asegúrese de que las instrucciones proporcionen información de funcionamiento completa, incluido el nombre del rotor o el radio máximo, las rpm o RCF y el tiempo de funcionamiento.

Uso de cálculos centrífugos

al revisar los protocolos publicados, asegúrese de que las instrucciones proporcionen información de funcionamiento completa, incluido el nombre del rotor o el radio máximo, las rpm o RCF y el tiempo de funcionamiento. Por ejemplo, a menos que también se especifique un rotor o se proporcione su radio máximo, no hay manera de saber qué RCF se necesita para lograr la separación. Un rotor como el JS-5.2 con un rmáx de 226 mm genera 4050 x g. Esta diferencia de 500 x g parece pequeña, pero es lo suficientemente grande para afectar los resultados de ciertas separaciones si se ignora. La preparación de los componentes de la sangre o el paso de sedimentación especificado mediante kits de radioinmunoensayo (radioimmunoassay, RIA) son ejemplos de separaciones que requieren mucha atención a las condiciones de centrifugación.

Muchos adaptadores que están diseñados para admitir cierta cantidad de tubos pequeños tienen bases de 10 a 15 mm o más gruesas. La mayoría de las separaciones no se verá afectada por esta pequeña reducción en el rmáx efectivo. Pero si necesita un cálculo más preciso del RCF al usar dichos adaptadores, tendrá que restar el grosor del fondo del adaptador al rmáx del rotor para obtener el rmáx efectivo para esa combinación de adaptador y rotor.

Esto no significa que un ciclo de funcionamiento realizado con un rotor no pueda duplicarse en un rotor con un rmáx diferente. Se pueden obtener los mismos resultados, pero se debe realizar un cambio en la velocidad (o tiempo de funcionamiento) del rotor para compensar la diferencia en el rmáx. Utilice el nomograma a continuación para seleccionar la velocidad. Al seguir estas instrucciones, puede calcular el RCF y las velocidades para rotores de distintos radios.

También puede calcular la velocidad adecuada para usar por medio de la ecuación de RCF a continuación. Digamos que desea seguir un procedimiento escrito para un rotor con un rmáx de 250 mm, que requiere un RCF de 3430 x g. Desea duplicar estas condiciones en el Beckman Coulter JS-5.2 que posee un rmáx de 226 mm. En este caso, debe transponer la ecuación para resolver la velocidad en rpm, entonces RCF = 1,12r (rpm/1000)2 por lo tanto.

El rotor JS-5.2 producirá un RCF de 3400 x g si funciona a aproximadamente a 3681 rpm. Si las instrucciones originales hubieran especificado la velocidad y el radio del rotor que se debían utilizar, en lugar del RCF, primero hubiera tenido que encontrar el RCF que esa combinación generaba, por medio del gráfico de nomograma para selección de velocidad anterior o la siguiente ecuación:

En ocasiones puede ser mejor cambiar el periodo durante el cual se centrifugan las muestras en lugar de cambiar la fuerza centrífuga. Es posible que desee duplicar un procedimiento que exige 10 minutos o una centrifugación a 3000 g. ¿Puede usar un rotor JR-3.2 que alcanza un RCF máximo de 2300 x g? Sí, pero tendrá que procesar las muestras un poco más. El tiempo necesario puede calcularse con la siguiente ecuación donde:

  • t1 = tiempo de funcionamiento necesario para el rotor JR-3.2
  • t2 = tiempo de funcionamiento especificado en el procedimiento
  • RCF1 = RCF del rotor JR-3.2 a la velocidad máxima
  • RCF2 = RCF especificado en el procedimiento;

por lo tanto, en nuestro ejemplo,

las instrucciones proporcionadas para los tiempos de centrifugación generalmente corresponden al tiempo configurado en el control de tiempo de la centrífuga. Este ajuste incluye el tiempo para que el rotor acelere y el tiempo a la velocidad operativa, pero no el tiempo de desaceleración. Este último depende del peso del rotor, incluida su carga, el tipo de sistema de freno y el ajuste de freno seleccionado por el operador. Si se utiliza un ajuste de freno máximo, un rotor con carga completa demora entre 1 y 3 minutos en desacelerar.

Obviamente, la sedimentación de las partículas en la muestra continúa durante la desaceleración, pero la tasa desciende a medida que el rotor se detiene. Al usar un ajuste de freno máximo se pueden obtener tiempos de desaceleración mínimos. Sin embargo, el frenado máximo en la fase final de desaceleración del rotor puede ser demasiado abrupto cuando se utilizan frascos o bolsas de sangre de diámetro grande; el resultado podría ser un revuelto indeseable o el material sedimentado nuevamente en suspensión. La presencia de este material nuevamente en suspensión puede interpretarse erróneamente como una separación deficiente.

Un aviso de precaución: antes de cambiar las condiciones de centrifugación, asegúrese completamente de que su muestra particular no se dañe con una sedimentación de partículas más dura o con un tiempo de centrifugación más prolongado. Los cambios pequeños generalmente no causan problemas. Sin embargo, algunas muestras biológicas se deterioran si se centrifugan demasiado, especialmente sin refrigeración. Y ciertos ensayos, que se venden en forma de kits, pueden ser sensibles al tiempo. Si tiene dudas, siga las instrucciones originales de la forma más exacta posible.