Los años 80 y 90: afrontar las fuerzas de fricción

La fuerza de fricción hace referencia a la fuerza generada por dos superficies que entran en contacto y se deslizan la una contra la otra; la intensidad de esta fuerza se ve afectada por la textura, el ángulo y la posición de las superficies, así como la cantidad de fuerza que las impulsa a juntarse.

A pesar de su valor demostrado para la comunidad de investigación, incluido el apoyo continuo de científicos muy respetados como Howard Schachman en la Universidad de California en Berkeley, la UCA comenzó a perder gran parte de su lustre a principios de la década de 1980.

Este problema se vio agravado por tres “fuerzas de fricción”.

Primero, la creencia de que la UCA era demasiado difícil de realizar para muchos experimentos habituales y en su lugar solo resultaba valiosa para los sistemas altamente purificados, y solo para los investigadores que buscaban una profunda comprensión química de una solución.16

Consecuentemente, muchos bioquímicos y biólogos moleculares comenzaron a determinar los pesos moleculares utilizando técnicas más sencillas y menos costosas, como la cromatografía de filtración en gel y la electroforesis en gel. Además, la cristalografía y la resonancia magnética nuclear (RMN) estaban empezando a obtener más atención y, como consecuencia, se prestaba menos atención a la UCA.9 De hecho, no fue inusual que los libros de texto publicados en la década de 1980 dejaran de publicar secciones sobre el tema de la ultracentrifugación analítica.

Los defensores argumentaron que la UCA era más fácil de realizar que otros métodos sistemáticos de biología molecular, y proporcionaba información exhaustiva y fácil de entender sobre las moléculas en solución, incluso sin análisis cuantitativos detallados. Un límite inesperadamente rápido o lento, por ejemplo, podría proporcionar la información necesaria para interpretar los resultados confusos obtenidos con otros métodos experimentales.16

La segunda fuerza de fricción estaba estrechamente relacionada con la primera.

A pesar del trabajo innovador que había realizado Fujita en las dos décadas anteriores, el análisis de las enormes cantidades de datos generados por la UCA seguía siendo una tarea compleja y que requería mucho tiempo. La extracción de coeficientes de sedimentación, coeficientes de difusión traslacional, coeficientes de fricción y masa boyante de los datos de velocidad de sedimentación era difícil, especialmente con mezclas complicadas, porque aún no existían soluciones simples al análisis de la ecuación de Lamm. 16

En tercer lugar, el interés general en la química biofísica de los biopolímeros había empezado a decaer en favor de los desarrollos emergentes en la biología molecular y la tecnología recombinante.11

Si entre la década de 1950 y la de 1970 se produjo el “momento de auge” de la UCA, parecía que el auge estaba a punto de acabar.

Lo que se siembra se cosecha: a 60 000 rpm

La ultracentrífuga analítica Beckman XL-A

Beckman XL-A Analytical Ultracentrifuge

En realidad, no tardó mucho en quedar claro que la ultracentrífuga analítica no estaba destinada a sufrir el mismo destino que el teléfono de disco y la cinta de ocho pistas.

A mediados de la década de 1980, era evidente que la RMN (en modo de alta resolución) y la cristalografía solo podían aplicarse a un número limitado de macromoléculas biológicas. Además, se demostró que las técnicas de filtración en gel y electroforesis en gel eran mucho menos fiables que la UCA para obtener pesos moleculares precisos, y los datos de peso molecular precisos eran fundamentales para evaluar la estructura de subunidades de los conjuntos macromoleculares.9

Y de forma irónica, en la década de 1990, algunos de los mismos avances en biología molecular y biotecnología que habían estado a punto de relegar a la UCA al cubo de basura de la historia científica (como la investigación sobre proteínas bioterapéuticas) requieren una comprensión aún más estricta de las interacciones físicas de los biopolímeros y las nanopartículas.

Como resultado, el interés por la UCA comenzó a recuperarse.

Este “renacimiento de la UCA” se aceleró enormemente en 1992 con la introducción de una nueva ultracentrífuga analítica innovadora de Beckman Instruments: la XL-A (actualmente denominada ProteomeLab XL-A y fabricada por Beckman Coulter Life Sciences).

Con toda la potencia analítica de una Spinco Modelo E pero un diseño que recuerda al Modelo L, la XL-A era compacta y fácil de operar. Y a diferencia de los modelos anteriores, la velocidad, la temperatura y la adquisición de datos del rotor se han computarizado.

Ahora, los experimentos que duraban de varias horas a muchos días se podían realizar con una intervención mínima del operador, y los datos podían verse y analizarse en tiempo real a medida que el experimento avanzaba.12

Recordando los días en los que Howard Schachman llamó a Ed Pickels en Spinco para sugerir mejoras, la nueva XL-A presentaba un sistema óptico de absorbancia y un monocromador de escaneado que permitía medir la concentración de la muestra en longitudes de onda de 190 a 800 nm.

La óptica de interferencia de Rayleigh se añadió más adelante a la ProteomeLab XL-A, creando un instrumento (la ProteomeLab XL-I) que podía registrar simultáneamente datos con ambos tipos de sistemas ópticos.

Como Schachman y Pickels habían aprendido décadas antes, cada sistema óptico tiene ciertas ventajas e inconvenientes. La óptica de absorción es especialmente útil para experimentos que afectan a ácidos nucleicos y para la detección de cualquier macromolécula que contenga cromóforos fuertes.

Por el contrario, el sistema óptico de interferencia es superior para analizar macromoléculas que carecen de cromóforos intensos (p. ej., polisacáridos), así como muestras que contienen componentes amortiguadores con gran absorción. También es el sistema óptico preferido para caracterizar muestras altamente concentradas.

Independientemente de qué sistema óptico se usara, las ultracentrífugas XL-A y XL-I representaron un avance extraordinario en la historia de la UCA.

En la década de 1960, la medición de pesos moleculares y la caracterización de patrones de asociación de una proteína simple que se autoasocia podían llevar varias semanas, incluso en el laboratorio mejor equipado. Ahora, estas mediciones se podían hacer de forma sistemática en unos días.

Por lo tanto, en lugar de considerarse un método desfasado, la UCA en la década de 1990 se estaba convirtiendo en el método preferido para aclarar una creciente variedad de propiedades de las macromoléculas en solución, entre las que se incluyen:

  • Tamaño
  • Distribución del tamaño
  • Pureza
  • Conformación macroscópica
  • No idealidad termodinámica (incluidos coeficientes viriales y de actividad)
  • Constantes de equilibrio para autoasociación
  • Unión al ligando y unión a otras macromoléculas
  • Estabilidad de complejos macromoleculares
  • Mecanismos de autoensamblaje
  • Caracterización de la estructura de geles y estructuras de red macromolecular

La tecnología concebida por Theodor Svedberg en los años 20, refinada por Beams y Pickels en los 40 y en la que invirtió el visionario Arnold Beckman en los años 50 estaba una vez más haciendo una importante contribución a la investigación de ciencias de la vida en todo el mundo.

Bueno, muy importante.

También fue aproximadamente en este momento cuando el gran defensor de la UCA, Howard Schachman, por entonces un respetado bioquímico de investigación y profesor de la escuela de posgrado de la Universidad de California en Berkeley, planteó una forma interesante de demostrar lo que estaba aprendiendo con la UCA sobre la estabilidad de los dímeros y los trímeros.

Según Schachman, que era conocido por su travieso sentido del humor, sus “modelos de mono” se convirtieron en una parte popular de la bibliografía del momento y ocuparon un lugar destacado en su conferencia para la Harvey Society en la Rockefeller University. 14 

No fue uno de los monos de Schachman, sin embargo, el que impulsaría el siguiente impulso hacia delante de la UCA.
Fue Lamm.

9 Harding SE. Analytical Ultracentrifugation and the genetic engineering of macromolecules. Biotechnol Genet Eng Rev 1993;11:317-356.
12Cole JL, Hansen JC. Analytical Ultracentrifugation as a contemporary biomolecular research tool. Journ Biomolec Tech 1999;10:163–176.
14 Howard Schachman, “University of California Professor of Molecular Biology: Discussions of His Research Over His Scientific Career From the 1940s Until 2010”, desarrollado por Sondra Schlesinger entre 2007 y 2010, Regional Oral History Office, The Bancroft Library, University of California, Berkeley, 2010.
16 Laue T. Analytical ultracentrifugation: a powerful ‘new’ technology in drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies 2004;1(3):309-315.