La UCA en el siglo XXI: nuevo análisis de Ole Lamm

A comienzos del siglo XXI, probablemente el desarrollo más importante relacionado con la UCA estuvo relacionado más con las matemáticas que con la ciencia de los experimentos de velocidad de sedimentación.

Mientras que Svedberg recibe la mayor parte del crédito por construir la primera ultracentrífuga analítica, la persona con mayor responsabilidad en la concepción de una forma de analizar los datos de velocidad de sedimentación fue un estudiante de doctorado de Svedberg procedente de Gotemburgo, Suecia.

Su nombre era Ole Albert Lamm.

En 1929 dedujo una ecuación general que describió el comportamiento del límite móvil en un campo ultracentrífugo. Más concretamente, su ecuación, que posteriormente recibiría su nombre, describió la distribución de la concentración de solutos resultantes de la sedimentación y difusión bajo ultracentrifugación en células con forma de sector clásicas.

Gracias a Lamm, el análisis de la sedimentación pudo describirse utilizando una ecuación única (diferencial). Lamentablemente, la ecuación de Lamm no se puede resolver directamente en el caso general. La solución exacta es una serie infinita de integrales que solo se puede resolver mediante integración numérica.

Ole Albert Lamm

Ole Albert Lamm

Desde la deducción de la ecuación de Lamm en 1929 y durante la mayor parte del siglo XX, la falta de una solución analítica explícita dificultó el análisis de la velocidad de sedimentación (VS) y las configuraciones experimentales limitadas.4

Sin embargo, a medida que aumentó el uso de la UCA, la ecuación de Lamm fue resuelta analíticamente (para casos limitantes específicos) por científicos como Hilding Faxén, W.J. Archibald y, más recientemente, Hiroshi Fujita. Pero con la llegada del año 2000, entramos de lleno en la era de la informática, una era que Svedberg y Lamm solo podían imaginar.

Los ordenadores ya no tenían el tamaño de un frigorífico. Los “ordenadores personales” se extendieron tanto como los televisores en los hogares de todo el mundo. Y con la introducción del software que permitió el uso de la adaptación directa de la ecuación de Lamm para el análisis de datos de VS,15 el enorme potencial de la ecuación de Lamm se podía materializar por fin.

Uno de esos programas de software era SEDFIT, desarrollado por Peter Schuck y sus colaboradores, que podía generar soluciones para la ecuación Lamm de forma rápida y rigurosa para ajustar los datos de VS.16

Junto con otros programas, SEDFIT lanzó nuevas estrategias y aplicaciones experimentales,4 y posibilitó la detección, cuantificación y caracterización de cantidades diminutas de contaminantes de soluciones.16

Los métodos de análisis anteriores resultaban problemáticos cuando se trabajaba con moléculas extremadamente pequeñas (peso molar < 3000) y="" moléculas="" extremadamente="" grandes="" (peso="" molar =""> 10 000 000). La introducción de estos nuevos programas de software eliminó estas limitaciones, lo que posibilitó, por ejemplo, la obtención de información útil sobre la asociación de péptidos pequeños y sobre la heterogeneidad y la agregación de virus.

Solo unos años más tarde, algunas de las nuevas soluciones de software de UCA fueron capaces de analizar los datos combinados de varios experimentos, incluidos los datos adquiridos utilizando diferentes métodos de principios básicos. Además, se disponía de otros programas basados en principios básicos de termodinámica para analizar los datos de equilibrio de sedimentación (SE, por sus siglas en inglés).17,18

Investigación de UCA y biofarmacéutica

Durante las dos primeras décadas del siglo actual, la UCA ha demostrado ser útil para muchas aplicaciones e industrias nuevas (p. ej., nanoproductos, como los usados en cosméticos y agentes de contraste biológicamente inertes).19

Pero uno de los usos más importantes y de gran alcance de la UCA ha estado en el campo en crecimiento de los productos biofarmacéuticos.

En combinación con nuevos programas de software analítico, la UCA se ha convertido en una herramienta potente para ayudar a los científicos biofarmacéuticos a evaluar el nivel total de agregación de un fármaco, caracterizar su heterogeneidad y la consistencia de la estructura de orden superior de su forma monomérica, y medir sus propiedades biofísicas en disolución.11

No solo puede proporcionar información independiente sobre la distribución de la cantidad y el tamaño de los agregados en muestras biofarmacéuticas en el tampón de formulación (prácticamente sin desarrollo de métodos), sino que, debido a que utiliza distintos principios de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés), la UCA evita problemas que pueden afectar negativamente a los resultados de la SEC.

Además, la UCA puede proporcionar esta información durante las etapas iniciales del desarrollo de los fármacos, antes de que se disponga de un método de SEC que funcione. Posteriormente, puede ayudar a garantizar que el método de SEC utilizado proporcione información de agregación significativa, incluso si el tampón de formulación de la muestra y la fase móvil de SEC difieren.11

En términos de tamaño de partículas, la UCA es mucho más versátil que la SEC, por lo que puede utilizarse para caracterizar compuestos biofarmacéuticos que van desde péptidos pequeños hasta partículas de proteínas grandes, como virus, partículas similivíricas (VLPS, por sus siglas en inglés) o nanopartículas utilizadas en sistemas de administración de fármacos para terapias génicas.

Muchos de estos nuevos tratamientos revolucionarios se centran en conquistar algunas de las formas más prevalentes y letales de cáncer, como las que se dirigen a páncreas, mama, colon, pulmones y próstata. Pero eso es solo el principio.

Igualmente emocionante es la aplicación de la UCA a tratamientos basados en anticuerpos, donde ya se considera un método de referencia, y a los sistemas de tratamiento basados en las glicovacunas y el ADN, así como tratamientos de base macromolecular para todo, desde las alergias hasta la obesidad.20

Es difícil exagerar la importancia de la tecnología de la UCA para nuestro mundo moderno.

Hoy, con la potente combinación de hardware (gracias a Svedberg, Pickels, Beckman y otros) y software (gracias a Lamm, Fujita y más tarde a Schuck y sus colaboradores), la UCA se ha convertido en una herramienta irreemplazable para la investigación macromolecular en el siglo XXI.

Lamentablemente, Arnold Beckman falleció en 2004 a los 104 años, por lo que solo pudo presenciar los primeros años del impacto resultante de esta potente fusión de ingeniería y programación informática.

Sin embargo, Howard Schachman fue capaz de presenciar mucho más la última evolución de la tecnología a la que había dedicado la mayor parte de su carrera y gran parte de su vida. Falleció a los 97 años de edad, en 2016.

Casualmente, ese año, Beckman Coulter Life Sciences presentó al mundo su ultracentrífuga analítica de última generación, la Optima AUC, que a Schachman casi seguro le habría encantado.

La Optima AUC: el establecimiento de un nuevo estándar

Beckman Coulter Life Sciences ha ayudado recientemente a devolver a la UCA al centro de la investigación de proteínas y la caracterización macromolecular al presentar la Optima AUC de nueva generación.

Con su mayor velocidad de escaneo, mayor precisión de longitud de onda y mejor resolución de datos, la Optima AUC puede proporcionar a los científicos respuestas más precisas en cada ejecución. A velocidades de rotor de hasta 60 000 rpm, las velocidades de adquisición de datos en la Optima AUC son casi cinco veces más rápidas que las de la ProteomeLab XL-A/XL-I, con una resolución radial tres veces mayor, por lo que puede generar casi 15 veces más datos.

Optima AUC

Optima AUC cuenta actualmente con sistemas ópticos de absorbancia o interferencia, con la opción de instalar hasta tres sistemas de detección independientes y simultáneos. A diferencia de la ProteomeLab XL-A/XL-I, todas las ópticas del sistema están contenidas fuera de la cámara del rotor, lo que hace más sencillo el mantenimiento de la Optima AUC.

Una pantalla táctil de 15" (38 cm) indica la progresión de los diseños experimentales. Las funciones de vigilancia remota permiten a los investigadores configurar, vigilar y extraer datos de experimentos desde prácticamente cualquier ubicación.

Compatible con las mismas células, rotores y software utilizados con ProteomeLab XL-A/XL-I, la Optima AUC supera otras características de su precursora en términos de resolución de imágenes y número de bandas de interferencia que puede capturar por célula.

Actualmente vivimos en un mundo hiperconectado. Por eso, no es sorprendente que la nueva Optima AUC permita a los investigadores vigilar sus experimentos desde cualquier lugar del mundo que ofrezca acceso a internet.

Sin duda, es posible que el futuro de la UCA no conozca límites en la actualidad.

4Schuck P. Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: discrete species and size-distributions of macromolecules and particles. Boca Raton (FL): CRC Press; 2016.
11 Berkowitz SA, Philo JS. Characterizing biopharmaceuticals using analytical ultracentrifugation. En: Houde DJ, Berkowitz SA, editores. Biophysical characterization of proteins in developing pharmaceuticals. Waltham (MA): Elsevier; 2015.
15 Schuck P. Sedimentation analysis of noninteracting and self-associating solutes using numerical solutions to the Lamm equation. Biophys J 1998;75:1503–1512.
16 Laue T. Analytical ultracentrifugation: a powerful ‘new’ technology in drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies 2004;1(3):309-315.
17 Johnson ML, Correia JJ, Yphantis DA, et al. Analysis of data from the analytical ultracentrifuge by nonlinear least-squares techniques. Biophys J 1981;36:575–588.
18Vistica J, Dam J, Balbo A, et al. Sedimentation equilibrium analysis of protein interactions with global implicit mass conservation constraints and systematic noise decomposition. Anal Biochem 2004;326:234–256.
19Kaur IP, Kakkar V, Deol PK, et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release 2014;193:51-62.